李 鑫，劉景玲，李 彥，郭萬(wàn)里，王大巾，梁宗鎖,,*

原花青素又稱為縮合單寧，為一類廣泛存在于植物不同組織中的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗微生物、保護(hù)心腦血管、抗糖尿病、減肥、美白等多種保健功能，同時(shí)具有良好的生物安全性，可被用作天然的植物功能性成分，營(yíng)養(yǎng)添加劑等，受到了越來(lái)越多的關(guān)注[1-5]。原花青素由黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元縮合而成，比較常見(jiàn)的有由（表）兒茶素縮合形成的原花青定（procyanidin，PC）以及由（表）沒(méi)食子兒茶素縮合形成的原翠雀定（prodelphinidin，PD）等，不同結(jié)構(gòu)原花青素的差異主要由結(jié)構(gòu)單元B環(huán)上的R1及C環(huán)上C2和C3的立體型決定，結(jié)構(gòu)單元C環(huán)上的R2可被酰基化或糖基化，通常為沒(méi)食子?；痆3]。結(jié)構(gòu)單元的連接方式有以C4—C6或C4—C8單連接鍵形成B型連接，以及以一個(gè)C—C鍵及一個(gè)C—O—C鍵的雙連接鍵形成A型連接[5-6]。根據(jù)聚合度的不同，原花青素可分為單體、低聚和高聚原花青素，如圖1所示[6]。結(jié)構(gòu)單元、連接方式、C環(huán)上R2取代基以及聚合度的異質(zhì)性，共同構(gòu)成了原花青素結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性和多樣性[5-8]。

圖1 典型的黃烷-3-醇單體及原花青素結(jié)構(gòu)Fig. 1 Typical chemical structures of flvan-3-ol monomer units and proanthocyanidins

核磁共振碳譜（13C nuclear magnetic resonance，13C NMR）、反相高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（reversedphase high performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry，RP-HPLC-ESI-MS）聯(lián)用以及基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）被認(rèn)為是分析原花青素結(jié)構(gòu)的有效手段[9-10]。利用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20可以比較方便地從含有原花青素的植物提取物中獲得純化的原花青素[10]。13C NMR能夠在一定程度上提供結(jié)構(gòu)單元的類型及比例、聚合度、連接方式、結(jié)構(gòu)單元的空間構(gòu)型及取代基信息[11-13]。對(duì)原花青素化學(xué)降解產(chǎn)物進(jìn)行RPHPLC-ESI-MS分析可獲得原花青素末端單元和延伸單元組成和平均聚合度信息[9-10,14]。MALDI-TOF MS作為一種軟離子化質(zhì)譜技術(shù)，被認(rèn)為是一種可以獲得原花青素較為全面的結(jié)構(gòu)信息的工具，通過(guò)MALDI-TOF MS可以獲得原花青素結(jié)構(gòu)單元的組成比例及連接方式，聚合度的分布范圍及取代基信息等[15-16]。在實(shí)際應(yīng)用中，通常需要將多種手段結(jié)合起來(lái)，以獲得原花青素全面的結(jié)構(gòu)信息[5-10]。

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），又名三葉崖爬藤，為葡萄科崖爬藤屬植物，為中國(guó)特有的珍稀植物[17]。三葉青全草都是寶，大量研究認(rèn)為，三葉青具有很好的抗氧化、抗炎、解熱、陣痛、抗病毒、抗腫瘤功效[18-23]，被認(rèn)為是一種“藥食兩相宜”的珍稀佳品。三葉青的化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要有黃酮、酚類、多糖、脂肪酸、磷脂、糖酯以及苯磺酸等[24-25]，三葉青的活性成分可能為黃酮和酚類物質(zhì)[20-23]。原花青素同時(shí)具有黃酮和酚的化學(xué)性質(zhì)，三葉青含有原花青，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的三葉青原花青素主要為兒茶素和表兒茶素2 種單體，原花青素B1、原花青素B2等幾種二聚體以及一種三聚體[26-30]，鮮見(jiàn)有關(guān)三葉青原花青素結(jié)構(gòu)更為全面的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑提取，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20純化的方法從三葉青根、莖、葉中制備原花青素，并利用13C NMR，RP-HPLC-ESI-MS聯(lián)合MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)純化的三葉青原花青素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以期為三葉青原花青素的基礎(chǔ)研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三葉青采自浙江杭州三葉青農(nóng)業(yè)科技有限公司，經(jīng)浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院梁宗鎖教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉青。將三葉青按根、莖及葉分開(kāi)，以去離子水洗凈，切碎，50 ℃烘干，粉碎并過(guò)40 目篩，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

氘代二甲亞砜（dimethyl sulfoxide-D6，DMSO-D6）、芐硫醇、氯化銫（純度≥99.999%）、Dowex?50W X8氫型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（200～400 目）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（色譜純），兒茶素、表兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（均為分析標(biāo)準(zhǔn)品） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 美國(guó)GE公司；2’,5-二羥基苯甲酸（2’,5-dihydroxybenzoic acid，DHB） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；甲醇、丙酮、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)TEDIA公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；AVANCE III 500核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司；4700 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀 美國(guó)ABI公司；1525二元高效液相色譜系統(tǒng)、2996光電二極管陣列檢測(cè)器美國(guó)Waters公司；LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 三葉青原花青素的提取及純化

分別取三葉青根、莖、葉粗粉100 g，加入1 000 mL體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液靜置30 min，然后設(shè)定提取時(shí)間30 min、溫度40 ℃、功率600 W進(jìn)行超聲波輔助提取，共提取3 次。提取液以布氏漏斗抽濾，合并濾液，濃縮液以1∶3（V/V）比例多次加入石油醚萃取，以充分除去濃縮液中的脂溶性物質(zhì)，將脫脂后的濃縮液凍干備用。

分別取葡聚糖凝膠100 g，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液充分溶脹，取層析柱（30 mm×600 mm）濕法裝柱，然后以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液平衡12 h。取凍干的提取物，以少量的體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解后上樣，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液充分洗脫，直至流出液在波長(zhǎng)280 nm處無(wú)吸收，換用體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃條件下減壓濃縮以除去丙酮，凍干，即得到純化的三葉青原花青素，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 三葉青原花青素結(jié)構(gòu)分析

1.3.2.113C NMR分析

取100 mg樣品以500 μL DMSO-D6溶解，用AVANCE III 500核磁共振波譜儀采集13C NMR數(shù)據(jù)，掃描頻率126 MHz，脈沖角45°，延遲時(shí)間3 s。

1.3.2.2 芐硫醇降解

于試管中依次加入200 μL的5 mg/mL樣品甲醇溶液，200 μL的體積分?jǐn)?shù)3.3%的鹽酸-甲醇溶液以及400 μL的體積分?jǐn)?shù)5%的芐硫醇-甲醇溶液，密封并混勻，40 ℃水浴30 min，冰浴冷卻，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行RP-HPLC-ESIMS分析。

1.3.2.3 RP-HPLC-ESI-MS分析

使用Waters 1525二元高效液相色譜儀及LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì)三葉青不同部位原花青素硫解產(chǎn)物進(jìn)行分析。色譜柱為Waters XBridge BEH Shield RP18柱（4.6 mm×250 mm，130 ?，5 μm）。二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.5%的TFA溶液，線性洗脫梯度如下：0～45 min，12%～80% A；45～50 min，80%～12% A。進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

ESI-MS使用RP-HPLC的色譜參數(shù)，分流比1∶3，質(zhì)譜條件：毛細(xì)管溫度400 ℃，電噴霧電壓4.50 kV，鞘氣壓力50 psi，輔助氣體壓力10 psi，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離能量（Source CID）10 V，碰撞能量50 V，負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～800。

三葉青原花青素硫解產(chǎn)物根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性，平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）根據(jù)色譜的峰面積計(jì)算，計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[14]：mDP=1＋延伸單元總峰面積/末端單元總峰面積。

1.3.2.4 MALDI-TOF MS分析

使用DHB作為基質(zhì)，氯化銫作為離子化試劑。樣品和基質(zhì)分別以10 mg/mL溶于體積分?jǐn)?shù)30%丙酮溶液，以Dowex?50W X8氫型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行充分的去離子處理，去離子后的樣品與1.52 mg/mL氯化銫溶液以1∶1（V/V）的比例充分混勻，混勻液立即與去離子后的基質(zhì)按照1∶3（V/V）的比例充分混勻，立即取1.0 μL點(diǎn)于潔凈的不銹鋼靶上，室溫條件下?lián)]干溶劑，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

本研究使用ABI 4700 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析。測(cè)定條件：正相氮?dú)饧す馄?，波長(zhǎng)337 nm，脈沖寬度3 ns，采用反射模式進(jìn)行分析，加速電壓20.0 kV，反射電壓23.0 kV，最優(yōu)質(zhì)量分辨率2 000 Da，正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為900～3 600 Da，結(jié)果由200～500 次激光激發(fā)累加得到。分析前使用外標(biāo)血管緊張素II（1 046.5 Da）、蛙皮素（1 619.8 Da）、ACTHclip18～39（2 465.2 Da）和生長(zhǎng)激素抑制素28（3 147.47 Da）對(duì)靶進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

三葉青原花青素芐硫醇降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果以 ±s表示，采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANVOA），P＜0.05，具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 13C NMR分析

圖2 三葉青根（A）、莖（B）及葉（C）原花青素的13C NMR譜圖Fig. 2 13C NMR spectra of proanthocyanidins from root (A), stem (B)and leaves (C) of T. hemsleyanum

采用13C NMR對(duì)三葉青原花青素結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖2所示。根據(jù)文獻(xiàn)[7-13]對(duì)譜圖中峰信號(hào)進(jìn)行解析，1號(hào)峰位于化學(xué)位移為δ 157～150之間，為A環(huán)上的C5、C7及C8的信號(hào)。2號(hào)峰位于δ 146處，為PD的C3’、C5’的信號(hào)，3號(hào)峰位于δ 145處，為PC的C3’、C4’的信號(hào)。δ 131附近的4號(hào)峰，為PC的C1’，PD的C1’、C4’的信號(hào)。δ 118附近的5號(hào)峰為PC的C6’的信號(hào)，δ 115附近的6號(hào)峰為PC的C2’及C5’的信號(hào)。7號(hào)峰位于δ 106附近，為PD的C2’及C6’，延伸單元的C8，2,3-反式構(gòu)型中延伸單元的C4a的信號(hào)，δ 101附近的8號(hào)峰為2,3-順式構(gòu)型中延伸單元的C4a信號(hào)，δ 99附近的9號(hào)峰為末端單元的C4a信號(hào)，而δ 95附近的10號(hào)峰為C6及末端單上C8的信號(hào)。11號(hào)峰位于δ 83附近，為2,3-反式構(gòu)型C2的信號(hào)，而2,3-順式構(gòu)型C2的信號(hào)為出現(xiàn)在δ 76處的12號(hào)峰，δ 72和δ 66附近的13、14號(hào)峰分別為延伸單元及末端單元的C3信號(hào)。δ 39.5附近的15號(hào)峰為溶劑DMSO-d6的碳信號(hào)。δ 36及δ 28附近的16、17號(hào)峰分別延伸單元及末端單元的C4信號(hào)。

三葉青根、莖及葉原花青素的13C NMR譜圖中都可以同時(shí)觀測(cè)到位于δ 146處的PD的C3’、C5’信號(hào)和δ 145處的PC的C3’、C4’信號(hào)，且PD信號(hào)的峰面積小于PC信號(hào)，說(shuō)明三葉青不同部位原花青素主要由PC和PD構(gòu)成，且以PC為主。在δ 83附近觀測(cè)到屬于2,3-反式構(gòu)型C2的信號(hào)，且信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于δ 76附近的屬于2,3-順式構(gòu)型C2的信號(hào)，表明三葉青不同部位原花青素均含有2,3-順式和2,3-反式構(gòu)型，且以2,3-順式構(gòu)型為主。由于采集到的譜圖分辨率不夠高，難以獲得更進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)信息。

2.2 硫解產(chǎn)物的RP-HPLC-ESI-MS分析

對(duì)原花青素的硫解產(chǎn)物進(jìn)行RP-HPLC-ESI-MS分析，可獲得原花青素末端單元和延伸單元組成以及聚合度信息，在酸性環(huán)境中，親核試劑芐硫醇可降解原花青素，末端單元以黃烷-3-醇的形式被釋放出來(lái)，延伸單元與芐硫醇形成對(duì)應(yīng)的芐硫醚加合物，對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分析可推測(cè)原花青素的結(jié)構(gòu)[9-10]。在芐硫醇的降解過(guò)程中，原花青素結(jié)構(gòu)單元C環(huán)C2和C3的立體構(gòu)型不受影響，被認(rèn)為是一種分析原花青素結(jié)構(gòu)的有效手段[14]。

注：同列肩標(biāo)小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

圖3 三葉青根（A）、莖（B）、葉（C）原花青素硫解產(chǎn)物及分析標(biāo)準(zhǔn)品（D）的HPLC圖Fig. 3 HPLC spectra of thiolytic degradation products of proanthocyanidins from root (A), stem (B), and leaves (C) of T. hemsleyanum and analytical standards (D)

本實(shí)驗(yàn)利用RP-HPLC-ESI-MS對(duì)原花青素芐硫醇降產(chǎn)物進(jìn)行分析，如圖3所示。三葉青不同部位原花青素具有相同的結(jié)構(gòu)單元，但組成比例上有所不同。峰1～4的分子離子[M-H]-分別為m/z 289、289、441、441，通過(guò)比對(duì)分析標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定峰1～4分別為兒茶素、表兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯及表兒茶素沒(méi)食子酸酯，為原花青素的末端單元。峰5～11的分子離子[M-H]-分別為m/z 427、427、579、411、411、563及123，通過(guò)比對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合參考文獻(xiàn)[10]鑒定為沒(méi)食子兒茶素芐硫醚、表沒(méi)食子兒茶素芐硫醚、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯芐硫醚、兒茶素芐硫醚、表兒茶素芐硫醚、兒茶素沒(méi)食子酸酯芐硫醚及過(guò)量的芐硫醇。

如表1所示，三葉青不同部位原花青素的末端單元主要為兒茶素和表兒茶素，含有少量的兒茶素沒(méi)食子酸酯及表兒茶素沒(méi)食子酸酯；延伸單元由表兒茶素、兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯以及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯組成，且以表兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素為主。C環(huán)C2和C3的立體構(gòu)型以2,3-順式為主。

通過(guò)對(duì)三葉青原花青素硫解產(chǎn)物RP-HPLC-ESI-MS的分析，三葉青根、莖及葉原花青素主要為（表）兒茶素和（表）沒(méi)食子兒茶素組成的PC和PD，此外，還含有少量的由（表）兒茶素沒(méi)食子酸酯組成的原花青定沒(méi)食子酸酯和由表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯組成的原翠雀定沒(méi)食子酸酯，與13C NMR分析結(jié)果基本一致，但RP-HPLCESI-MS由于具有更高的靈敏度，檢測(cè)出了13C NMR未能檢測(cè)出的（表）兒茶素沒(méi)食子酸酯及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯結(jié)構(gòu)單元，并發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子?；慕Y(jié)構(gòu)單元主要存在于延伸單元。利用RP-HPLC-ESI-MS分析獲得了三葉青原花青素準(zhǔn)確的mDP，三葉青根、莖及葉原花青素的mDP分別為4.89±0.33、3.77±0.19及4.45±0.48。

2.3 MALDI-TOF MS分析

盡管利用13C NMR和RP-HPLC-ESI-MS從不同角度獲得了三葉青原花青素的結(jié)構(gòu)信息，但無(wú)法獲得三葉青原花青素聚合度的分布和連接情況的信息。MALDI-TOF MS作為一種高靈敏度的軟離子化質(zhì)譜，在分析非揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)上具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是分析原花青素結(jié)構(gòu)多樣性的有效工具。MALDI-TOF MS能夠直接給出不同聚合度、不同分子質(zhì)量原花青素準(zhǔn)確的分子離子峰，可用于研究原花青素的基本結(jié)構(gòu)單元、聚合度的分布范圍以及連接方式[9-10]。使用MALDI-TOF MS技術(shù)分析原花青素可能會(huì)受基質(zhì)種類、樣品去離子化情況、陽(yáng)離子化試劑的選擇、激光強(qiáng)度、樣品和基質(zhì)的混勻程度等多種因素的影響，因此，必須綜合考慮這些因素以獲得原花青素“準(zhǔn)確”的結(jié)構(gòu)信息[31-32]。

本研究采用反射模式，對(duì)三葉青原花青素進(jìn)行去離子處理后，引入陽(yáng)離子化試劑Cs＋并使用DHB為基質(zhì)，使用ABI 4700 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀獲得了三葉青原花青素清晰的MALDI-TOF MS圖，如圖4所示。三葉青原花青素的質(zhì)譜圖非常復(fù)雜，周期性分布的峰體現(xiàn)了三葉青原花青素結(jié)構(gòu)上多分散性和復(fù)雜性，表明三葉青不同部位的原花青素為分散的多聚體。根據(jù)13C NMR和RP-HPLC-ESI-MS的分析結(jié)果，三葉青不同部位的原花青素均為主要由（表）兒茶素、（表）沒(méi)食子兒茶素以及（表）兒茶素沒(méi)食子酸酯等結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的原花青素多聚體，參考周海超等[15]的方法，建立解析方程：[M＋Cs]＋=133＋2＋288a＋304b＋152c-2d，其中，m/z 133是Cs＋的相對(duì)原子質(zhì)量，m/z 2代表2 個(gè)末端H，a、b、c及d分別代表（表）兒茶素（m/z 288）、（表）沒(méi)食子兒茶素（m/z 304）、沒(méi)食子酰基（m/z 152）以及A型連接在原花青素分子中的個(gè)數(shù)，將由解析方程和計(jì)算出的理論[M＋Cs]＋值和實(shí)際測(cè)得的[M＋Cs]＋值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者能夠互相吻合（表2），表明所建立的解析方程是可信的。

圖4 三葉青根（A）、莖（B）及葉（C）原花青素MALDI-TOF MS圖Fig. 4 MALDI-TOF mass spectra of proanthocyanidins from roots (A),stem (B) and leaves (C) of T. hemsleyanum

從圖4及表2可以看出，三葉青不同部位原花青素在聚合度分布和連接類型上具有較高的相似性，但不完全一致，三葉青根、莖原花青素可以觀測(cè)到從三聚體（m/z 999）到十聚體（m/z 3015）分布的多聚體，三葉青葉原花青素則可以觀測(cè)到高達(dá)十一聚體（m/z 3319）的多聚原花青素，三葉青根、莖及葉質(zhì)譜圖中離子峰最強(qiáng)的都是一個(gè)四聚體（m/z 1 303），而每個(gè)聚體內(nèi)部的聚合物都存在由于結(jié)構(gòu)單元的不同或者結(jié)構(gòu)單元之間連接方式不同而形成的差異，三葉青根、莖及葉原花青素從三聚體到十聚體中離子峰最強(qiáng)的m/z序列分別為1 015-1 303-1 575-1 879-2 167-2 439-2 743-3 031、1 015-1 303-1 591-1 879-2 199-2 471-2 791-3 079以及999-1 303-1 591-1 895-2 183-2 487-2 775-3 079，且在離子峰最強(qiáng)的m/z信號(hào)附近可觀測(cè)到一系列相差16 Da的離子峰信號(hào)（圖4A、C中放大的五聚體），如1 575-1 591-1 607-1 623，而16 Da是一個(gè)（表）沒(méi)食子兒茶素結(jié)構(gòu)單元和一個(gè)（表）兒茶素結(jié)構(gòu)單元之間的分子質(zhì)量差值，因此認(rèn)為在每個(gè)聚體內(nèi)部，存在著一系列由不同個(gè)數(shù)（表）沒(méi)食子兒茶素結(jié)構(gòu)單元和（表）兒茶素結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的復(fù)雜連接，如離子峰m/z 1 575是由5 個(gè)（表）兒茶素結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的五聚體，而離子峰m/z 1 591則是由4 個(gè)（表）兒茶素和1 個(gè)（表）沒(méi)食子兒茶素構(gòu)成的五聚體，離子峰m/z 1 607則是由3 個(gè)（表）兒茶素和2 個(gè)（表）沒(méi)食子兒茶素構(gòu)成的五聚體，離子峰m/z 1 623則是由2 個(gè)（表）兒茶素和3 個(gè)（表）沒(méi)食子兒茶素構(gòu)成的五聚體。

表2 MALDI-TOF MS分析三葉青根、莖及葉原花青素Table 2 MALDI-TOF MS analysis of proanthocyanidins from roots,stem and leaves of T. hemsleyanum

續(xù)表2

續(xù)表2

從三葉青根、莖及葉的原花青素質(zhì)譜圖中（圖4A、C中放大的五聚體），從三聚體到十聚體都能夠觀察到一系列和主要離子峰相差152 Da的離子峰，而152 Da是一個(gè)沒(méi)食子?；姆肿淤|(zhì)量，表示三葉青原花青素中普遍存在沒(méi)食子?；?。而根據(jù)RP-HPLC-ESI-MS的結(jié)果，認(rèn)為沒(méi)食子?；饕匝由靻卧系谋韮翰杷貨](méi)食子酸酯的形式存在，結(jié)合MALDI-TOF MS結(jié)果，認(rèn)為每個(gè)含有沒(méi)食子酰基的原花青素分子中，只含有一個(gè)沒(méi)食子?；?，三葉青不同部位原花青素都有一定程度的沒(méi)食子?；?，沒(méi)食子酰基化程度從高到低依次為葉、根及莖原花青素。

多聚原花青素結(jié)構(gòu)單元之間的連接方式，除了以C4—C6或C4—C8單連接鍵構(gòu)成的B型連接，還能夠以1個(gè)C—C鍵及1個(gè)C—O—C鍵的雙連接鍵形成A型連接，A型連接比B型連接多消耗2 個(gè)H，則當(dāng)聚合度不變的情況下，含有A型連接的原花青素分子質(zhì)量小于不含A型連接的原花青素，反映到MALDI-TOF MS譜圖上，則會(huì)觀測(cè)到一系列相差2 Da的離子峰序列[5]（圖4B中放大的三聚體）。以三葉青莖原花青素放大的三聚體部分為例，從譜圖中可清晰地觀測(cè)到一系列差值為2 Da的離子峰序列如m/z 995-997-999、m/z 1 011-1 013-1 015以及m/z 1 027-1 029-1 031等，說(shuō)明A型連接的存在，通過(guò)MALDITOF MS分析，三葉青根、莖及葉原花青素的三聚體至九聚體均檢出A型連接的存在，除部分三聚體含有2 個(gè)A型連接外，其他聚體的原花青素至多檢出1 個(gè)A型連接，說(shuō)明三葉青不同部位原花青素中普遍存在A型連接。

3 結(jié) 論

原花青素是由黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元縮合形成的復(fù)雜植物多酚，本研究利用溶劑提取，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20純化的方法，從采自浙江杭州的三葉青根、莖及葉中得到了純化的原花青素。利用13C NMR、RP-HPLCESI-MS聯(lián)合MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)三葉青不同部位的原花青素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明三葉青根、莖及葉原花青素主要由PC和PD構(gòu)成，三葉青不同部位原花青素的末端單元以兒茶素為主，延伸單元以表兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素為主，三葉青根、莖及葉原花青素的mDP分別為4.89±0.33、3.77±0.19及4.45±0.48。利用MALDITOF MS檢測(cè)出三葉青根、莖原花青素的三聚體到十聚體，葉原花青素的三聚體到十一聚體，每個(gè)聚體內(nèi)部普遍存在（表）兒茶素和（表）沒(méi)食子兒茶素結(jié)構(gòu)單元，沒(méi)食子?；约癆型連接。三葉青根、莖及葉原花青素在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性。本研究結(jié)果可為三葉青原花青素的基礎(chǔ)研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。