于國萍，陳 媛，姚宇秀，范美婧，劉 鵬，董良偉

原料乳中營養(yǎng)成分比較高，是各種細(xì)菌滋生的絕佳環(huán)境，原料乳可以為其提供充足的養(yǎng)分和合適的pH值，所以原料乳中有著相對密集的微生物[1]，其數(shù)量從幾百到幾千CFU/g不等[2]。其中部分微生物能夠改善乳制品的口感等，這些微生物并不都是有益的，有的是有害的，可以引發(fā)比較嚴(yán)重的疾病[3]。原料乳中常見的微生物有3 大類，即有益微生物、有害微生物和病原微生物[4]。

原料乳中有益微生物主要是乳酸菌，而乳酸菌主要包括鏈球菌、明串珠菌和乳桿菌屬等。有害微生物常稱為腐敗菌，其中最主要的就是嗜冷菌。病原微生物通常是致病菌，它即便不改變?nèi)榈男再|(zhì)，卻也可以造成疾病，引發(fā)大規(guī)模的感染。原料乳中食源性致病菌主要為大腸桿菌O157:H7、沙門菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及志賀菌等[5-8]。

由于乳及乳制品具有較高的營養(yǎng)成分，我國對其的需求越來越大，因此對原料乳的微生物的檢測也比較重要[9]，原料乳中微生物多樣性的檢測方法也從原來的純培養(yǎng)手段轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿由飳W(xué)手段[10-11]。Fricker等[12]采用純培養(yǎng)和分子方法相結(jié)合的手段研究了微生物的多樣性，Bonizzi等[13]采用了內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析了微生物的構(gòu)成，Raats等[14]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和克隆文庫的方法對原料乳及其冷藏過程中菌群的變化進(jìn)行研究。其中，純培養(yǎng)的手段比較繁瑣，而DGGE等分子生物學(xué)技術(shù)很難全面地反映微生物的多樣性。

隨著乳及乳制品的大量生產(chǎn)，我國乳制品的質(zhì)量問題經(jīng)常出現(xiàn)[15]，這很大程度上是由于乳及乳制品中感染了致病菌，導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生。因此，加強(qiáng)原料乳的質(zhì)量安全檢測至關(guān)重要，可以防止大規(guī)模食源性疾病的發(fā)生[16-17]。目前使用的檢測方法大多為分子方法[18-22]，已有研究分別采用不同的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測了乳中致病菌。雖然目前的分子檢測方法有很多優(yōu)勢，但是仍舊檢測不全面，因此本實驗采用高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）手段對原料乳的菌種進(jìn)行檢測。

HTS又叫“下一代”測序技術(shù)[23-24]，主要是能同時對很多樣本中提取的DNA進(jìn)行測序，效率非常高。HTS技術(shù)給過去分子水平的生物測序技術(shù)帶去了革命性的創(chuàng)新，已經(jīng)普遍利用到關(guān)于基因組測序等一系列分子水平的測序方法上[25-27]。本實驗主要采用的是Illumina公司的MiSeq測序平臺[28]，MiSeq個人測序系統(tǒng)采用Illumina的TruSeq邊合成邊測序技術(shù)。第2代測序Illumina MiSeq方法分析有效的避免了通量低、操作復(fù)雜和準(zhǔn)確率低等缺陷[29-32]，具有操作簡單、成本較低的優(yōu)勢，并且采用邊合成邊測序原理，結(jié)果可信度高。

本實驗主要是利用HTS的方法測定原料乳中菌種的分布情況。采集14 個奶牛場的原料乳，通過HTS的方法（采用Illumina MiSeq系統(tǒng)）測定菌群多樣性分布情況，然后根據(jù)測序結(jié)果，了解原料乳中菌群的分布情況，為構(gòu)建奶牛養(yǎng)殖風(fēng)險防控機(jī)制，并提出防控奶牛養(yǎng)殖風(fēng)險的對策提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳 黑龍江省內(nèi)14 個奶牛場提供。

E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒 瑞士Omega公司；Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；Taq DNA Polymerase 美國Thermo公司；Agencourt AMPure XP美國Beckman公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21型臺式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；GL-88B型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H型混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21型電泳槽北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；Q32866型Qubit?2.0熒光計 美國Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler型PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

在黑龍江?。òü枮I、雙城、阿城等地）14 個奶牛場采集原料乳，將樣本放在－20 ℃的冰箱里面凍存，并進(jìn)行后續(xù)的實驗，按采集的奶牛場的順序分別標(biāo)記為1～14。

1.3.2 樣品的前處理

將凍存后的樣品進(jìn)行解凍，因為菌株樣品和原料乳屬于液體，所以其中包括的菌種的數(shù)目相對較低，進(jìn)行后續(xù)實驗之前一定要將樣本混合均勻，樣本的菌種比較豐富時，吸取一定量的樣本進(jìn)行離心，倒出液體，留下離心后的菌種。

1.3.3 DNA的提取

DNA的具體提取步驟參照E.Z.N.ATM Soil DNA試劑盒進(jìn)行，按說明書操作。所提取的DNA于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 瓊脂糖電泳

將提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳。將一定量的DNA與一定量的上樣緩沖液按比例混合，然后吸取其中的混合液10 μL進(jìn)行DNA電泳，條件為200 V、45min，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察。

1.3.5 PCR擴(kuò)增

1.3.5.1 第1輪擴(kuò)增

PCR采用雙引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列是V3-V4通用雙引物[33]。主要是先將DNA產(chǎn)物加入試劑盒中的各項物質(zhì)形成1 個體系，需要加入的物質(zhì)為PCR緩沖液、核苷酸、DNA樣品、Bar-PCR primer F、Primer R、Plantium Taq、雙蒸水，使整個反應(yīng)體系體積為50 μL。

將混合好的物質(zhì)放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，主要步驟是：先進(jìn)行預(yù)變性，然后進(jìn)行變性過程，需要將其循環(huán)多次，最后延伸即可。之后進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。

1.3.5.2 第2輪擴(kuò)增

引入Illumina橋式PCR兼容引物，第2次PCR需要加入的物質(zhì)與第1次類似，只是加入的量不同，同樣是使整個反應(yīng)體系是50 μL。擴(kuò)增的步驟與方法見1.3.5.1節(jié)。

1.3.6 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

將PCR后物質(zhì)進(jìn)行DNA電泳，步驟同1.3.4節(jié)。

1.3.7 DNA純化回收

將擴(kuò)增后物質(zhì)進(jìn)行DNA的純化回收，不同微生物的擴(kuò)增后的物質(zhì)采用的回收的方法基本一致，不同的是選擇的磁珠不同。具體步驟是：用磁珠對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行吸附，吸附3 次，在吸附的過程中，需要將其放在磁力架上，保證它的吸附力。最后用洗脫液洗脫后保存到小的EP管中，進(jìn)行后續(xù)的實驗。

1.3.8 定量混合

利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA進(jìn)行定量。最后要將純化后的DNA與原來的進(jìn)行混合，使最后進(jìn)行測序的物質(zhì)濃度為20 pmol/L。

1.3.9 數(shù)據(jù)預(yù)處理

1.3.9.1 原始序列數(shù)據(jù)

經(jīng)過系統(tǒng)整理的數(shù)據(jù)可以經(jīng)過一個系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成為最初的測序序列，即Raw Data，將其保存到電腦中，它是由所有的序列信息和與其相關(guān)的質(zhì)量數(shù)據(jù)組成。

1.3.9.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

經(jīng)過HTS后的數(shù)據(jù)含有多余的序列，所以在處理數(shù)據(jù)之前應(yīng)該先將多余的序列除去，然后才可以進(jìn)入系統(tǒng)中進(jìn)行測序。開始先將多余的引物除去，之后成對的read拼接成一條序列，將序列通過系統(tǒng)識別，將不同樣本的數(shù)據(jù)分開，最終對樣本中的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查，去掉不合格的數(shù)據(jù)，留下最后的有效數(shù)據(jù)。

1.3.10 去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列

在進(jìn)行PCR擴(kuò)增的時候，有時候會出現(xiàn)嵌合體，它通常是由于在第1輪擴(kuò)增過程中的延伸階段，并沒有完全進(jìn)行，只反應(yīng)到了一半，使得產(chǎn)物不完整，這些不完整的產(chǎn)物會進(jìn)行下一次擴(kuò)增，可能會使其加入一些與之不同的片段，形成一種雜交的DNA，這就是嵌合體。同時也會產(chǎn)生一些非特異性擴(kuò)增序列。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要將這些嵌合體除掉。使用Usearch去非擴(kuò)增區(qū)域序列。先采用uchime驗證這個序列是嵌合體，驗證成功后將其去除。

1.3.11 分析項目

操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析：依據(jù)每個序列之間的遠(yuǎn)近程度進(jìn)行分析，將距離近的歸為一個OTU。選擇其中最典型的序列進(jìn)行檢測，通常選擇序列數(shù)目多的作為典型性序列，然后根據(jù)OTU的分類情況進(jìn)行了聚類分析。

Alpha多樣性分析：衡量樣本物種多樣性。計算物種并制作所有樣品豐富度指數(shù)、Chao、Shannon、Simpson、Coverage等物種多樣性指數(shù)，箱形圖和稀釋性曲線。根據(jù)各樣本的OTU豐度分布情況繪制相對豐度曲線。

物種分類分析：將樣本中的序列進(jìn)行分類后，分類后的序列屬于一個菌屬，然后根據(jù)菌屬的數(shù)量進(jìn)行分析。基于物種分類分析，繪制物種分類條形圖、物種豐度餅圖、物種豐度熱圖、單樣本群落分布豐度柱狀圖、群落分布分度3D圖、樣本聚類與柱狀圖組合分析圖、菌群分布條形圖等。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Mothur 1.30.1軟件、FLASH 1.2.3軟件、pear 0.9.6軟件、Usearch 5.2.236軟件、Cytoscape 3.2軟件、R 3.2軟件等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU基本情況

將提取的DNA進(jìn)行電泳，并將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，目的是檢測DNA的完整性及其是否能進(jìn)行后續(xù)的實驗，擴(kuò)增后的條帶比較亮，說明可以進(jìn)行后續(xù)的實驗。OTU指在生物學(xué)系統(tǒng)中，為了詳細(xì)認(rèn)識樣本中菌種的具體分布情況，要將測序的結(jié)果按種類開始統(tǒng)計，人為規(guī)定一個分組的單位稱為一個OTU。一般情況下，認(rèn)定2 個序列相似度為97%時屬于一個菌屬，當(dāng)相似度為99%時，認(rèn)定其是一個菌種。本實驗采用的相似度為97%為一個OTU。

2.2 基于OTU豐度的樣本聚類圖

樣本聚類樹圖可以直觀地反映樣本間的相似度，具體方法如下：首先使用描述群落組成關(guān)系和結(jié)構(gòu)的算法計算樣品間的距離，依據(jù)常用的一種算法創(chuàng)造一個或者多個節(jié)點(diǎn)的圖譜，算法是非加權(quán)組平均法，算出一個結(jié)構(gòu)圖譜，可以直接觀察圖譜分析數(shù)據(jù)，計算樣本間距離的方法為布雷柯蒂斯距離。在目前的統(tǒng)計學(xué)里，聚類分析全是利用布雷柯蒂斯距離分析的，它能夠顯示菌落差異，因此本實驗使用該參數(shù)反映菌落的差異。原料乳的14 個樣本的基于OTU的樣本聚類樹圖見圖1，樹枝的長度代表樣本間距離，分支的寬度表示樣本間的距離的遠(yuǎn)近，相似度高的樣本距離越小。由圖1可以看出，原料乳的14 個樣本類聚成2 個主要群體，3、4、5、6、7、8、9、10、11是一類，1、2、12、13、14是另一類。其中12和13是最相似的兩個樣本。整體看14 個樣本，相似度差別略大，可能是由于在黑龍江省不同的區(qū)域進(jìn)行取樣，地域的差異性導(dǎo)致的。

圖1 基于OTU的樣本聚類樹圖Fig. 1 Clustering dendrogram based on OTU samples

2.3 稀釋性曲線

為確定所得到的結(jié)果正確性，是否能進(jìn)行后面的實驗，需要進(jìn)行稀釋性曲線分析，它主要是從整個樣品的數(shù)據(jù)里面抽取部分進(jìn)行分析，分析其所包含的菌種的多少，是通過抽取的個體與物種的數(shù)目建立圖譜。通過該曲線能夠分析樣品的菌種數(shù)是否豐富，也可以分析結(jié)果是否正確。隨機(jī)選擇樣本中的一部分序列，將其指代的OTU與序列數(shù)繪制稀釋曲線，如圖2所示，沿著橫坐標(biāo)曲線逐漸穩(wěn)定時，看出結(jié)果分析比較合理，相反，如果曲線不穩(wěn)定，說明結(jié)果不合理，不能進(jìn)行分析。所以，通過觀察該曲線，能看出樣本是否檢測完全。整個曲線都是依據(jù)相似度97%繪制的。由圖2可以看出，所有樣本的曲線都隨著樣本中隨機(jī)抽取序列數(shù)增大而逐漸穩(wěn)定，說明結(jié)果比較合理，所含菌種數(shù)較多，可以進(jìn)行后續(xù)的測序。

圖2 Shannon指數(shù)稀釋分析圖Fig. 2 Rarefaction curves for Shannon index

2.4 Rank-abundance曲線

為了直觀地表示每個樣本中菌種的數(shù)目是否豐富，進(jìn)一步繪制了Rank-abundance曲線，它與多樣性指數(shù)一樣，可以看出樣本的多樣性。主要是計算每個樣本中的各個OTU包括的序列數(shù)目，按照從大到小進(jìn)行排列，繪制曲線如圖3所示。當(dāng)然，Rank-abundance曲線能夠表示樣本菌種數(shù)目的兩大部分，包括樣本中所含的菌種的豐度及其是否均勻。曲線的寬度代表了菌種的豐度，曲線越寬，說明所包含的菌種越多；曲線的平穩(wěn)程度代表了其菌種數(shù)目是否均勻，曲線越穩(wěn)定，說明菌種的構(gòu)成越均勻。由圖3可以看出，所有的樣本在橫坐標(biāo)上的寬度的范圍分布較廣，說明所含菌種的數(shù)目較多，組成豐富；同時可以看出曲線比較穩(wěn)定，說明菌種的構(gòu)成比較均勻。

圖3 Rank-abundance曲線圖Fig. 3 Rank-abundance curves

2.5 物種累積曲線

為了確定樣品中的菌種的數(shù)目是否會根據(jù)樣本的數(shù)目增加而增加，繪制了物種累積曲線圖，由其可看出測序的菌種數(shù)是否完全檢測出來，也可以看出樣本中的菌種數(shù)量是否滿足需要。根據(jù)曲線的走向不但能夠知道樣本中菌種是否足夠，也可以看出樣品中物種的豐度。物種累積曲線代表了隨著樣本的增加是否會有新的OTU出現(xiàn)。在曲線中，隨著樣本的增加，如果曲線快速增長，說明有更多的OTU檢測出來；如果曲線增長緩慢，說明沒有更多的OTU檢測出來，說明結(jié)果合理。因此通過該曲線能夠判斷樣品量是否滿足需要，如果曲線快速增長，需要加入足夠的樣品量滿足測序分析，相反的話，就可以直接進(jìn)行后續(xù)的實驗。由圖4可以看出，沿著橫坐標(biāo)樣本的增多，曲線增長比較緩慢，說明沒有更多的OTU檢測出來，說明樣品量足夠，可以滿足需要。

圖4 物種累積曲線圖Fig. 4 Species accumulation curves

2.6 物種豐度熱圖

圖5 屬水平物種豐度熱圖Fig. 5 Heat map of species abundance at genus level

菌群數(shù)量用熱圖顏色標(biāo)記，曲線制作過程是將菌落的數(shù)量聚類分析，把分析后的結(jié)果體現(xiàn)在熱圖中。原料乳中14 個樣本的屬水平物種豐度熱圖，如圖5所示，顏色越紅說明所含的該菌種的數(shù)量越多，顏色越藍(lán)則說明所含的菌種不多。為了展示效果，只顯示豐度最高的前50 個物種分類信息，剩余的物種分類合并成其他。由圖5可以看出，14 個樣本的前5 種菌種的顯示顏色比較紅，含量比較多，分別是腸球菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、乳球菌屬，其中第4個豐度較高的菌屬并沒有與之匹配的數(shù)據(jù)庫。其他菌屬中有的樣本顏色比較紅，有的樣本顏色比較暗，說明每個樣本中菌群的豐度不同，可以看出所有樣本的菌群的多樣性。

2.7 所有樣本菌群分布條形分析

圖6 原料乳的菌群分析條形圖Fig. 6 Barplot for bacterial genus distribution in raw milk

依據(jù)微生物的特性，重點(diǎn)分析菌種的菌群分布，通過菌群分布條形圖可以看出菌種的大概分布，所占的比例等，另外還可以看出不同的樣本之前的差異。由于菌群的結(jié)構(gòu)圖包括單樣本群落分布豐度柱狀圖，群落分布分度3D圖，樣本聚類與柱狀圖組合分析圖、菌群分布條形圖等，本實驗用菌群分布條形圖來代表。由圖6可以看出，原料乳的14 個樣品的菌種的分布情況。1、2、12、13、14號奶牛場的原料乳中腸球菌屬、芽孢桿菌屬較多，3、4號奶牛場中乳球菌屬較多，5號奶牛場中不動桿菌屬較多，6、7號奶牛場中苯基桿菌較多，8號奶牛場中梭狀芽孢桿菌較多，9、10號奶牛場中假單胞菌屬較多，11號奶牛場中慢生根瘤菌科中的一個屬較多。在結(jié)果中關(guān)于致病菌的菌種和菌屬，可以得知1、2中有金黃色葡萄球菌，2、5、8、10中有志賀菌，其他樣本的致病菌暫時沒有檢測出來。

3 結(jié) 論

本實驗率先將HTS技術(shù)應(yīng)用在原料乳的菌群的研究中，通過HTS技術(shù)了解原料乳中菌群的分布情況。由此可知不同牧場原料乳的菌群存在多樣性，位于前列的分別是腸球菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、乳球菌屬，部分原料乳中有金黃色葡萄球菌和志賀菌的存在。相關(guān)領(lǐng)域研究者采用不同的方法對原料乳菌群分布進(jìn)行研究，例如，李博等[34]利用宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察的方法檢測原料乳中的主要微生物，即在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌群，觀察生長情況，結(jié)果表明原料乳中含有乳酸菌、大腸桿菌、嗜冷菌；Pourhanssan等[35]采用革蘭氏染色結(jié)合鏡檢的方法對原料乳中的菌群進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果表明原料乳中有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌、克雷白氏桿菌屬、綠膿桿菌以及變形桿菌屬；相較于HTS，分離培養(yǎng)、生化鑒定無法對難培養(yǎng)或者不可培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測，存在特異性差、操作復(fù)雜、耗時等缺點(diǎn)，無法實現(xiàn)及時有效檢測。劉洋等[36]利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定原料乳中細(xì)菌菌落分布，鑒定出原料乳中含有乳酸菌、腸桿菌、金黃色葡萄球菌；與這些方法相比，HTS的研究結(jié)果更加全面地反映了原料乳菌群分布多樣性及豐度信息。此外，夏圍圍等[37]利用HTS和DGGE分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的比較研究中，得出HTS能夠較為全面和準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而DGGE僅能分析有限的優(yōu)勢微生物類群，存在高估物種豐度以及低估微生物群落大小和多樣性的可能。因此應(yīng)該嚴(yán)格控制奶牛生活環(huán)境的衛(wèi)生情況，防止金黃色葡萄球菌和志賀菌污染原料乳，保障原料乳質(zhì)量安全，為有關(guān)部門控制原料乳及儲奶設(shè)施的衛(wèi)生條件提供有力的理論和實驗依據(jù)。

本研究利用HTS方法，對原料乳的菌群分布情況進(jìn)行了較全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測，具有很高的特異性和靈敏度，并為原料乳中致病菌檢測提供了技術(shù)支持。隨著HTS技術(shù)的不斷推進(jìn)，相信在不久的將來，它會在食品的檢測領(lǐng)域有更廣泛和全面的應(yīng)用前景。