趙城彬，張 浩，許秀穎，鄭明珠，曹 勇，修 琳，蔡 丹，劉景圣*

玉米醇溶蛋白（Zein）屬于醇溶谷蛋白類，主要通過溶劑提取法從玉米加工副產(chǎn)物玉米黃粉中獲得，是一種有價值的食品原料，具有環(huán)保、可生物降解、無毒、可食用、用途廣等優(yōu)點[1]。Zein具有較高比例的非極性氨基酸殘基，占總氨基酸含量的50%以上，使其具有較高的疏水性[2]，導致其不溶于水而溶于乙醇溶液中，限制了其功能性質的發(fā)揮。近年來蛋白質糖基化改性受到國內外學者的廣泛關注，采用糖基化反應制備改性蛋白應用于食品配方中是一種最具潛力的方法。蛋白質的糖基化是依據(jù)美拉德反應原理，由蛋白質的非質子化氨基與糖分子的還原羰基之間發(fā)生縮合反應形成席夫堿，然后生成糖基胺重排產(chǎn)物[3]。蛋白質與多糖通過糖基化反應形成復合物能夠提高蛋白質的乳化性、熱穩(wěn)定性、抗菌活性和許多其他功能性質[4]。此外，研究表明糖基化反應能夠大幅降低蛋白質的致敏性，這與致敏蛋白的結構改變有關[5]。由于該反應不需要催化劑，并在可控的條件下獲得所需的反應產(chǎn)物，可以作為新功能性材料應用于食品工業(yè)、生物材料及醫(yī)藥科學等領域[6]。目前，有許多關于糖基化反應提高蛋白質功能性質的研究，主要集中在卵清蛋白、溶解酵素、大豆蛋白和乳清蛋白與葡聚糖（dextran，DX）、殼聚糖和半乳甘露聚糖的復合。然而，關于Zein與不同分子質量DX的糖基化產(chǎn)物結構和功能性的研究鮮有報道。本實驗采用濕熱法制備Zein-DX糖基化產(chǎn)物，對其溶解度、表面疏水性和乳化性進行測定，同時采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）技術對蛋白質的分子結構進行分析，探討不同分子質量DX對Zein糖基化產(chǎn)物結構和功能性的影響，為改善玉米蛋白功能性質和促進玉米精深加工技術提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Zein 百靈威科技有限公司；DX（分子質量為6、20、40、70 kDa） 美國Sigma公司；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid，ANS）美國Sigma公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

pHS-3C型酸度計 上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 天津天泰儀器有限公司；高速離心機上海安亭科學儀器廠；Alpha1-4LDplus冷凍干燥機 德國Christ公司；1600PC紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；VERTEX 70 FTIR儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 Zein-DX糖基化產(chǎn)物的制備

根據(jù)Yin Baoru等[7]的制備方法，將Zein分散到KCl-NaOH緩沖液（0.2 mol/L，pH 12.0）中，常溫下磁力攪拌1 h使蛋白質充分溶解，配成1 g/100 mL的Zein溶液。以蛋白與多糖質量比為2∶1的比例添加6、20、40、70 kDa的DX，磁力攪拌均勻得到混合溶液，然后在85 ℃水浴中熱處理2 h，冰浴冷卻至室溫，離心分離取上清液，調節(jié)pH 7.0，4 ℃透析24 h，冷凍干燥即得Zein-DX糖基化產(chǎn)物，分別用Zein-DX6、Zein-DX20、Zein-DX40、Zein-DX70表示。不含DX的天然Zein為對照組。

1.3.2 接枝度的測定

采用OPA試劑法測定接枝度。將80 mg的OPA溶解在2 mL體積分數(shù)95%的乙醇溶液中，并與50 mL 10 mmol/L的四硼酸鈉緩沖液（pH 9.7）、5 mL 20 g/100 mL的SDS以及200 μL的β-巰基乙醇混合，充分混勻后用蒸餾水稀釋至100 mL配成OPA試劑。將200 μL的蛋白樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL的OPA試劑在室溫體積下反應5 min，然后采用紫外-可見分光光度計測定340 nm波長處的吸光度，以天然Zein作為對照，接枝度的計算公式如下：

式中：DG為接枝度/%；Ac為對照樣的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.3 褐變強度的測定

采用0.1 g/100 mL的SDS溶液將樣品溶液稀釋至蛋白質量濃度為0.2 g/100 mL，空白樣為SDS溶液，在420 nm波長處測定吸光度A420nm，以A420nm表示褐變強度。

1.3.4 溶解度的測定

將樣品配成蛋白質量濃度為1 g/100 mL的溶液，室溫磁力攪拌1 h，采用0.1 mol/L的HCl溶液和0.1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值分別為2、4、6、8、10、12，然后在12 000×g離心30 min。采用Lowry法測定上清液中蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線。蛋白質的溶解度以上清液中蛋白質量占樣品中總蛋白質量的百分比表示。

1.3.5 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質表面疏水性。將蛋白樣品溶于pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸緩沖液中，配成質量濃度為0.05～1 mg/mL的蛋白溶液，采用相同的緩沖液配制8 mmol/L的ANS溶液。將40 μL的ANS溶液添加到4 mL的蛋白溶液中，充分振蕩混勻后測定熒光強度。激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，夾縫寬均為5 nm。以熒光強度對蛋白濃度作圖，曲線的初始斜率即為蛋白質的表面疏水性（h0）。

1.3.6 乳化性的測定

根據(jù)Molina等[8]的濁度法對乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）進行測定。將蛋白樣品溶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）中，配成蛋白質量濃度為5 mg/mL的溶液，取15 mL的蛋白溶液與5 mL的大豆油混合，采用高速均質機在12 000 r/min均質乳化1 min，分別在第0、30分鐘時，從測試管底部取50 μL樣品，用0.1 g/100 mL的SDS溶液稀釋100 倍，采用Spectra Max 190酶標儀在500 nm波長處測定樣品的吸光度，以SDS溶液作為空白。EAI和ESI的計算公式如下：

式中：A0和A30分別為第0、30分鐘時的吸光度；DF為稀釋倍數(shù)（100）；C為蛋白質質量濃度/（g/mL）；φ為乳狀液中油相所占比例（0.25）。

1.3.7 FTIR的測定

參照Zhang Xuan等[9]的方法測定FTIR，將蛋白樣品與溴化鉀研磨成均勻粉末，壓片后置于FTIR儀中進行測定。FTIR儀的測定溫度為25 ℃，波數(shù)掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，掃描次數(shù)為64 次。利用PeakFit Version 4.12軟件對酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）譜圖進行擬合處理，根據(jù)其擬合后的子峰面積計算各二級結構含量。

1.4 統(tǒng)計分析

每組實驗重復3 次，采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，作圖采用Origin 8.5軟件完成，P小于0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 Zein-DX糖基化產(chǎn)物接枝度和褐變強度分析

糖基化反應以美拉德反應為基礎，即蛋白質的ε-氨基和多糖的還原羰基之間的反應，可以通過接枝度和褐變強度評價反應程度[10]。由圖1可知，不同分子質量DX與Zein發(fā)生糖基化反應的接枝度不同，隨著多糖分子質量的增加，糖基化產(chǎn)物的接枝度逐漸降低，且當DX分子質量增加到40 kDa和70 kDa時，糖基化產(chǎn)物的接枝度變化不顯著。糖基化反應過程中能夠產(chǎn)生褐色物質，使產(chǎn)物在420 nm波長處的吸光度增加，說明蛋白質與多糖之間發(fā)生了糖基化反應。DX分子質量對褐變強度的影響與接枝度相似，也是隨著分子質量的增加而逐漸降低，這表明低分子質量（6 kDa）的DX具有更強的反應活性，Zein更容易與6 kDa的DX發(fā)生糖基化反應。Spotti等[11]在乳清蛋白與DX糖基化產(chǎn)物的研究中也得到類似的結果，這可能是由于低分子質量多糖的空間位阻較小，更容易靠近蛋白質的氨基，在相同的DX濃度下，更多的還原羰基參與糖基化反應，導致反應程度增大。

圖1 Zein-DX糖基化產(chǎn)物接枝度和褐變強度（A420 nm）Fig. 1 Degree of graft (DG) and browning intensity (A420 nm) of Zein-DX glycosylation products

2.2 Zein-DX糖基化產(chǎn)物溶解度分析

圖2 Zein-DX糖基化產(chǎn)物溶解度隨pH值的變化Fig. 2 Changes in solubility of Zein-DX glycosylation products with pH

如圖2所示，在pH 2～12范圍內，Zein的溶解度較低，最高不超過30%。Zein在pH 6時溶解度最低，推斷Zein的等電點可能在pH 6附近，這與楊光等[12]的研究結果一致。Zein與DX發(fā)生糖基化反應可以顯著提高Zein在整個pH值范圍內的溶解度，且不會改變Zein的等電點，這可能是由于Zein與DX結合后，在蛋白質分子中引入了親水性羥基，增加了蛋白質和水分子的親和力[13]。此外，蛋白質在等電點附近由于靜電相互作用會發(fā)生聚集，然而Zein-DX糖基化產(chǎn)物在等電點附近具有比對照組Zein更高的溶解度，這表明DX能夠為蛋白質提供空間位阻穩(wěn)定作用[14]。隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的溶解度逐漸降低，但仍高于對照組Zein，說明低分子質量（6 kDa）的DX與Zein形成的糖基化產(chǎn)物具有更高的溶解度，這可能與較高的接枝度有關（圖1）。

2.3 Zein-DX糖基化產(chǎn)物表面疏水性分析

蛋白質的表面疏水性（h0）與其分子結構的穩(wěn)定性有關，這對于蛋白質的表面性質具有重要影響。由圖3可知，與對照組Zein相比，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的表面疏水性顯著降低，這可能是由于親水糖鏈的共價結合增加了蛋白質的親水性[15]，以及多糖鏈的遮蔽作用使熒光探針難以與蛋白質分子內部的疏水基團結合[16]，從而導致蛋白質表面疏水性的降低。Zhang Yating等[17]對大豆蛋白-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物的表面疏水性進行研究，發(fā)現(xiàn)糖基化作用會使蛋白質的表面疏水性降低，這與本研究得到的結果相似。隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的表面疏水性略有增加，但仍低于對照組Zein，即低分子質量（6 kDa）的DX與Zein形成的糖基化產(chǎn)物具有更低的表面疏水性，這可能與較高的接枝度有關（圖1）。高接枝度的糖基化產(chǎn)物引入的親水性羥基較多，進一步增加蛋白質表面親水性，從而導致表面疏水性降低。Achouri等[18]在大豆11S球蛋白功能性質的研究中發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白的表面疏水性隨著接枝度的增加而逐漸降低，Mu Lixia等[19]研究發(fā)現(xiàn)隨著更多的多糖與蛋白質共價結合，蛋白質表面疏水性降低得更快，這些研究均與本實驗得到的結果一致。

圖3 Zein-DX糖基化產(chǎn)物表面疏水性Fig. 3 Surface hydrophobicity of Zein-DX glycosylation products

2.4 Zein-DX糖基化產(chǎn)物乳化性分析

圖4 Zein-DX糖基化產(chǎn)物EAI和ESIFig. 4 Emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability index(ESI) of Zein-DX glycosylation products

由圖4可知，糖基化作用能夠顯著提高Zein的EAI和ESI，這可能是由于Zein分子中引入了帶有親水基團的DX，有效提高了蛋白質親水性。此外，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的空間結構變得松散，使蛋白質分子內部的疏水基團適當暴露，改善了蛋白質的親水/疏水平衡，導致界面張力降低，從而提高了蛋白質的乳化性[20]。隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的EAI逐漸降低，表明低分子質量（6 kDa）DX的共價結合能夠使Zein具有更高的EAI，說明Zein-DX6在油-水界面中具有較大的吸附量，能夠阻止油滴聚集[21]，這可能與較高的接枝度有關（圖1）。隨著DX分子質量的增大，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的ESI逐漸增加，這可能與高分子質量多糖具有較大的空間位阻作用有關。Pugnaloni等[22]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質與多糖形成的糖基化產(chǎn)物具有較好的ESI，由于大分子多糖具有較大的空間位阻作用，在油水界面形成多分子層結構，有效減少油滴聚集，從而改善蛋白質乳化性，這與本實驗的研究結果一致。

2.5 Zein-DX糖基化產(chǎn)物FTIR分析

FTIR是通過分子內原子間的振動引起輻射吸收，從而提供蛋白質的化學組成和構象結構信息[23]。由圖5可知，對照組Zein具有3 個特征峰，分別為酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）、酰胺II帶（1 530～1 550 cm-1）、酰胺III帶（1 240～1 450 cm-1），這與孫步云等[24]對玉米粉中蛋白質FTIR的研究結果類似。

圖5 Zein-DX糖基化產(chǎn)物FTIRFig. 5 Fourier transform infrared spectra (FTIR) of Zein-DX glycosylation products

對于Zein-DX糖基化產(chǎn)物來說，在1 409 cm-1和1 694 cm-1處的吸收強度顯著增加，這分別是由酰胺I帶中C＝O伸縮振動和酰胺III帶中C—N伸縮振動、N—H變形振動產(chǎn)生的。Su Junfeng等[25]將大豆分離蛋白與羧甲基纖維素進行糖基化反應，同樣發(fā)現(xiàn)在酰胺I帶和酰胺III帶的吸收強度發(fā)生改變，這可能是糖基化過程中產(chǎn)生的希夫堿等中間產(chǎn)物引起吸收峰的增強。Zein-DX糖基化產(chǎn)物在1 000～1 260 cm-1波長范圍內出現(xiàn)明顯吸收峰，這是由糖分子中C—O—C糖苷鍵的伸縮振動產(chǎn)生的[26]；在3 396 cm-1處吸收強度增大是由于糖分子中游離—OH的伸縮振動引起的[27]，這說明Zein與DX以共價鍵形成了復合物。此外，在545、860 cm-1和2 928 cm-1處Zein-DX糖基化產(chǎn)物的吸收峰均變強，這可能是由CH3基團中C—H（sp3）反對稱伸縮振動產(chǎn)生的[28]，進一步證實了Zein與DX形成了共價復合物。值得注意的是，隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的FTIR吸收強度增大。這表明盡管6 kDa的DX反應活性最大（圖1），但是高分子質量多糖對Zein-DX糖基化產(chǎn)物FTIR吸收強度的影響更加顯著。

蛋白質FTIR的酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）主要是C＝O鍵的伸縮振動，可反映蛋白質的二級結構信息[29]。采用二階導數(shù)紅外去卷積光譜擬合法對二級結構進行定量分析，利用PeakFit v4.12軟件對酰胺I帶圖譜進行擬合，根據(jù)Zhao Xiaoyan等[30]的報道，擬合圖譜中各子峰與二級結構類型對應關系為1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結構，1 610～1 640 cm-1為β-折疊結構，1 660～1 700 cm-1為β-轉角結構，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲結構。通過計算各子峰面積與酰胺I帶總峰面積之比，即可得到4種類型二級結構的含量，結果見表1。

表1 Zein-DX糖基化產(chǎn)物的二級結構含量Table 1 Secondary structure contents of Zein-DX glycosylation products%

由表1可以看出，對照組Zein的二級結構組成為35.46%的α-螺旋結構、25.62%的β-折疊結構、22.37%的β-轉角結構和16.55%的無規(guī)則卷曲結構。Cabra等[31]在α-Zein二級結構的研究中發(fā)現(xiàn)α-螺旋是主要的二級結構，其含量達到40%，這與本實驗的研究結果相近。與對照組Zein相比，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的α-螺旋含量顯著降低（P＜0.05），β-折疊和無規(guī)則卷曲含量顯著增加（P＜0.05），β-轉角含量變化不顯著（P＞0.05）。蛋白質與多糖的糖基化作用主要是氨基與還原羰基的縮合反應，這發(fā)生在蛋白質分子α-螺旋結構及其附近區(qū)域內。α-螺旋結構的減少主要是由于多糖與α-螺旋結構內的氨基結合而導致的[32]。糖基化反應使Zein的二級結構發(fā)生顯著改變，由有序的α-螺旋結構轉變?yōu)闊o序的β-折疊和無規(guī)則卷曲結構，這表明Zein空間結構變得更加松散，蛋白分子結構展開，柔韌性增加[33]。Li Chen等[34]在花生分離蛋白糖基化復合物的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。此外，隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的α-螺旋含量進一步降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量進一步增加，表明高分子質量多糖的共價結合能夠使Zein的分子構象變得更加靈活和松散，這可能與高分子質量多糖的空間位阻作用有關[35]。當DX分子質量增加到40 kDa和70 kDa時，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的二級結構變化不顯著（P＞0.05），說明多糖分子質量增加到一定程度時，不會對Zein分子二級結構產(chǎn)生更大的影響。

3 結 論

采用濕熱法將Zein與不同分子質量DX發(fā)生糖基化反應，隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的接枝度和褐變強度降低，說明Zein更容易與低分子質量DX發(fā)生糖基化反應，這會導致糖基化產(chǎn)物具有更高的溶解度和更低的表面疏水性。乳化性分析表明，糖基化作用能夠提高Zein的EAI和ESI，隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的EAI逐漸降低，ESI逐漸增加。FTIR證明了Zein與DX形成了糖基化共價復合物，對酰胺I帶進行擬合分析表明，隨著DX分子質量的增加，Zein-DX糖基化產(chǎn)物的α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，表明高分子質量多糖的共價結合能夠使Zein的分子構象變得更加靈活和松散。