左袁袁， 呂 寒， 吳月嫻， 陳 劍， 簡(jiǎn)暾昱， 任冰如，①， 李維林

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心， 江蘇 南京 210014； 2. 南京林業(yè)大學(xué)， 江蘇 南京 210037〕

國(guó)產(chǎn)菱屬(TrapaLinn.)植物僅包含歐菱(T.natansLinn.)和細(xì)果野菱(T.incisaSieb. et Zucc.)2種[1]，全國(guó)各地均有分布，長(zhǎng)江流域?yàn)橹饕植紖^(qū)和栽培區(qū)。該屬植物的果實(shí)統(tǒng)稱為菱角，《本草綱目》中記載菱角具有解暑、解傷寒積熱、止消渴和解酒毒的功效；子葉富含淀粉，可食用；菱角殼具有降血糖、抗氧化、抗癌和抗腫瘤等[2-4]藥理活性，含黃酮類[5-6]、總多酚類[3，6]、萜類和甾體類[7]、苯丙素類[6]以及生物堿類[8]等成分，主要活性成分為總多酚。

為明確不同產(chǎn)地菱角殼中總多酚含量的差異，作者對(duì)來(lái)源于11個(gè)省(自治區(qū))13個(gè)產(chǎn)地的菱角殼中總多酚含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其抗氧化活性和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用進(jìn)行了比較，以期為菱角殼的深度研究和開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試歐菱果實(shí)于2017年8月取自廣西(桂林)、山東(棗莊)、浙江(嘉興和金華)、河南(信陽(yáng))、湖北(洪湖)、福建(建甌)、安徽(馬鞍山)、湖南(沅江)、江西(新余)、江蘇(南京和蘇州)和廣東(揭陽(yáng))11個(gè)省(自治區(qū))的13個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所任冰如研究員鑒定。各產(chǎn)地分別采集新鮮歐菱果實(shí)(菱角)約1kg，人工剝?nèi)×饨菤?，自然陰干，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

主要儀器：EL204電子天平〔梅特勒-托利多(上海)有限公司〕、SpectraMax Plus384光吸收酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)、KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、Thermo Finnpipette精密單通道加樣器(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)和Transferpette-8型精密八通道移液排槍(德國(guó)Brand公司)。

主要試劑：沒(méi)食子酸對(duì)照品(純度大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)、α-葡萄糖苷酶(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)、對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG，純度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、Folin-Ciocalteu試劑(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(分析純，上海生工生物工程有限公司)；K2S2O8、Na2PO4·12H2O、K2PO4、無(wú)水乙醇和Na2CO3均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，用超純水溶解并配制成質(zhì)量濃度99.70 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，并按照文獻(xiàn)[9]的方法，采用Folin-Ciocalteu試劑法測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(y)、沒(méi)食子酸含量為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.411 6x+0.206 2(r=0.997 5)，線性范圍0.000 0～4.990 0 μg。

1.2.2 樣品中總多酚的提取 通過(guò)前期對(duì)提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇以及50%丙酮)的預(yù)實(shí)驗(yàn)確定以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為提取溶劑。分別稱取各樣品粉末1.00 g，精密加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇50.0 mL，超聲(300 W，30 ℃)提取40 min，冷卻后過(guò)濾，濾液即為總多酚提取液。用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇將總多酚提取液稀釋4倍，制成供試樣液。分別精密量取供試樣液5 μL，按對(duì)照品溶液的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總多酚含量。每份樣品均重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 方法學(xué)考察 精密吸取對(duì)照品溶液5 μL，按對(duì)照品溶液的測(cè)定方法，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，RSD值為0.04%，表明儀器精密度良好。取湖北洪湖產(chǎn)樣品的供試樣液，按對(duì)照品溶液的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，并分別顯色反應(yīng)0、20、40、60、80、100和120 min，RSD值為1.20%，表明供試樣液顯色后在2 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。取湖北洪湖產(chǎn)樣品粉末6份并按上述方法制成供試樣液，按對(duì)照品溶液的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，RSD值為0.80%，表明該方法重復(fù)性較好。取廣西桂林產(chǎn)樣品粉末(總多酚含量已知)6份，每份0.05 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇50 mL和質(zhì)量濃度99.70 μg·mL-1沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液7.5 mL，按上述樣品中總多酚的提取和測(cè)定方法測(cè)定吸光度，并且計(jì)算回收率，平均回收率為99.96%，RSD值為0.08%。

1.2.4 抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定 用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇將上述各樣品的總多酚提取液稀釋16倍，制成供試樣液。分別測(cè)定供試樣液對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除率及對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用EXCEL 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果和分析

不同產(chǎn)地菱角殼樣品中總多酚含量及其總多酚提取物對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除率及對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率見(jiàn)表1。結(jié)果表明：浙江嘉興產(chǎn)樣品中總多酚含量最高(54.54 mg·g-1)，山東棗莊產(chǎn)樣品中總多酚含量最低(8.15 mg·g-1)且與其他產(chǎn)地樣品中總多酚含量差異顯著(P<0.05)；其他產(chǎn)地樣品中總多酚含量均存在不同程度的差異。

產(chǎn)地Location總多酚含量/(mg·g-1)Total phenols contentDPPH·清除率/%DPPH· scavenging rateABTS+·清除率/%ABTS+· scavenging rateα-葡萄糖苷酶活性抑制率/%α-glucosidase activity inhibition rate廣西桂林Guilin of Guangxi15.11±0.03e33.76±1.58h22.54±1.07j34.43±1.09h山東棗莊Zaozhuang of Shan-dong8.15±0.01f44.01±1.89g25.80±1.04i29.65±1.02i浙江嘉興Jiaxing of Zhejiang54.54±0.02a80.60±4.47a70.19±3.68a78.02±3.74a浙江金華Jinhua of Zhejiang38.05±0.04b48.76±2.65f55.41±2.12d57.85±1.56d河南信陽(yáng)Xinyang of He’nan34.85±0.02b77.76±4.47a55.38±2.79d53.23±1.63e湖北洪湖Honghu of Hubei35.54±0.01b75.51±3.30b52.22±1.48e55.24±2.86d福建建甌Jian’ou of Fujian27.46±0.04d66.24±1.04d58.36±2.86c41.73±1.30g安徽馬鞍山Ma’anshan of An-hui32.50±0.02c74.66±3.85b49.16±2.39f49.12±1.45f湖南沅江Yuanjiang of Hu’nan30.12±0.03c66.42±2.65d55.53±1.77d47.44±1.79f江西新余Xinyu of Jiangxi31.71±0.03c61.98±1.82e45.38±2.19g47.30±2.24f江蘇南京Nanjing of Jiangsu39.70±0.05b72.56±3.91c54.77±2.83d66.17±2.88c江蘇蘇州Suzhou of Jiangsu13.39±0.01e44.85±2.79g34.19±1.53h29.09±2.00i廣東揭陽(yáng)Jieyang of Guangdong47.87±0.09a73.48±3.77c63.86±4.75b71.82±3.60b

1)以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為溶劑 Taking volume fraction of 60% ethanol as solvent. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

浙江嘉興產(chǎn)樣品的總多酚提取物對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除率最高，分別達(dá)到80.60%和70.19%；廣西桂林產(chǎn)樣品的總多酚提取物對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除率最低，分別僅為33.76%和22.54%，且與其他產(chǎn)地的樣品差異顯著。浙江嘉興產(chǎn)樣品的總多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最高(78.02%)；江蘇蘇州產(chǎn)樣品的總多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最低(29.09%)，且總體上與其他產(chǎn)地的樣品差異顯著?？傮w上看，不同產(chǎn)地樣品的總多酚提取物均具有清除DPPH·和ABTS+·的活性及對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，但不同產(chǎn)地間存在差異。浙江嘉興產(chǎn)樣品中總多酚含量及其總多酚提取物對(duì)DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均顯著高于其他產(chǎn)地。

相關(guān)性分析表明：菱角殼中總多酚含量與其DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.788、0.916和0.977。

3 討論和結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同產(chǎn)地菱角殼中總多酚含量及其總多酚提取物對(duì)DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均存在差異，除與各產(chǎn)地栽培品種本身的遺傳差異有關(guān)外，還可能與產(chǎn)地的氣候和水土環(huán)境等因子以及栽培管理措施有關(guān)。

菱角殼分為內(nèi)果皮和外果皮，內(nèi)果皮由質(zhì)地堅(jiān)硬的木質(zhì)化纖維組織組成，而外果皮呈膜質(zhì)，在果殼總質(zhì)量中占比很小，但卻是總多酚及其他化學(xué)成分存在的主要場(chǎng)所。從果皮結(jié)構(gòu)上看，浙江嘉興產(chǎn)菱角殼的內(nèi)果皮相對(duì)較薄且質(zhì)地較疏松，在果殼質(zhì)量中占比相對(duì)較小，而其外果皮占比相對(duì)較大，總多酚含量相對(duì)較高，因而，浙江嘉興產(chǎn)菱角殼中總多酚含量及其總多酚提取物對(duì)DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率總體上顯著高于其他產(chǎn)地。

相關(guān)性分析表明：菱角殼中總多酚含量與其總多酚提取物對(duì)DPPH·清除率、ABTS+·清除率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率均呈顯著正相關(guān)，表明多酚類成分可能是菱角殼抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的主要活性成分。相關(guān)研究表明：氧化應(yīng)激與糖尿病[11]、腫瘤[12]和炎癥[13]等疾病密切相關(guān)，因此，菱角殼可作為抗糖尿病及其他疾病的藥用植物資源進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。鑒于浙江嘉興產(chǎn)菱角殼中總多酚含量較高，且抗氧化活性和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均較強(qiáng)，可首先用于研究和開(kāi)發(fā)。