王繼榮 暴一眾 楊舟鑫 呂曉玲 胡細(xì)連 王國(guó)付

浙江醫(yī)院，浙江省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310013

隨著人口老齡化，目前我國(guó)50歲以上的骨質(zhì)疏松及骨量減少的人數(shù)逐年增多，預(yù)計(jì)到2050年，此數(shù)量將達(dá)2.12億[1]。目前應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的藥物主要為西藥，但這類藥物多數(shù)具有嚴(yán)重或潛在的不良反應(yīng)[2-3]。中醫(yī)藥及天然藥物在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面具有很好的發(fā)展?jié)摿Α，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示秦皮乙素(esculetin，Esc)具有多種藥理作用，如抑制5-脂氧合酶、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等[4]。有研究發(fā)現(xiàn)秦皮乙素對(duì)破骨細(xì)胞分化有調(diào)控作用[5]，但其對(duì)成骨細(xì)胞分化尤其是整體動(dòng)物中對(duì)骨量維持的作用尚不得而知。為了避免雌激素的影響，本研究利用增齡性骨質(zhì)疏松癥小鼠模型觀察秦皮乙素對(duì)骨量維持的作用，并進(jìn)一步利用骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived stroma cell，BMSCs)初步探討其對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7月齡雄性C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCK(京)2012-0001，合格證編號(hào)：11400700163033。在浙江大學(xué)城市學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施為SPF級(jí)。

1.1.2主要藥品與試劑：秦皮乙素(成都瑞芬思生物科技有限公司)，RNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)，熒光定量PCR試劑盒(TOYOBO公司)，HE染液(碧云天生物技術(shù)研究所)，茜素紅染液(美國(guó)Sigma公司)，β-甘油磷酸鈉(美國(guó)Sigma公司)，地塞米松(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3主要儀器設(shè)備：小動(dòng)物骨密度及體成分分析儀(韓國(guó)InAlyzer)，Roche480熒光定量PCR儀(德國(guó)Roche公司)，生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)，石蠟包埋機(jī)與切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥：取7月齡C57BL/6小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組、秦皮乙素200 mg/kg與400 mg/kg給藥組，每組8只。對(duì)照組灌胃給予生理鹽水，秦皮乙素組分別灌胃給予秦皮乙素溶液，藥物濃度分別為40 mg/mL與80 mg/mL，給藥體積為0.5 mL/100 g。

1.2.2取材及樣品制備：給藥3個(gè)月后，用3%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)腹腔注射麻醉處死小鼠，75%酒精消毒后，于生物安全柜中分離小鼠左側(cè)股骨與脛骨組織，剔除肌肉組織，用1 mL注射器抽取已經(jīng)預(yù)先配好的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨發(fā)白，收集沖洗液，反復(fù)吹打使細(xì)胞打散，移至滅菌的10 mL離心管中，4℃1600rpm離心5 min，棄上清，用小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/mL，接種到T25培養(yǎng)瓶，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，輕輕吸出上清，并加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，獲得骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。將右側(cè)脛骨組織置于4%中性福爾馬林，固定72 h后，14% EDTA(pH7.4)脫鈣，每3 d換一次脫鈣液，連續(xù)脫鈣1個(gè)月。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)：(1)骨密度檢測(cè)：取固定好未脫鈣的脛骨組織，置于InAlyzer小動(dòng)物骨密度測(cè)定儀中掃描。(2)茜素紅染色：上述BMSCs細(xì)胞種于6孔板中，添加成骨誘導(dǎo)液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.05 mmol/L VC，100 mmol/L地塞米松)誘導(dǎo)，每3 d換液一次，28 d后PBS沖洗3次；95%酒精固定15 min，蒸餾水沖洗后用茜素紅染液(0.1 mmol/L的Tris-HCl 100 mL(pH=8.3)，加入0.1 g茜素紅S)于37 ℃染色30 min，蒸餾水沖洗后晾干拍照。(3)HE染色：脫鈣完成后的脛骨組織用PBS清洗3次，然后進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水，苯透明，石蠟包埋，待石蠟?zāi)毯驦eica切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為5 μm。待切片黏附到載玻片后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行HE染色，染色后進(jìn)行封片并在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。(4)熒光定量PCR：利用RNA提取試劑盒提取各小鼠BMSCs總RNA，用TOYOBO的逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，并使用TOYOBO的PCR Master Mix來(lái)進(jìn)行熒光定量PCR。使用Light Cycler480(Roche)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過(guò)繪制融解曲線來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 秦皮乙素對(duì)小鼠脛骨骨密度的影響

圖2 各組小鼠脛骨組織HE染色比較Fig.2 H& E staining of tibia in each group

圖3 各組小鼠成骨細(xì)胞茜素紅染色及定量比較Fig.3 Alizarin-red staining of osteoblasts and quantitative determination in each group

利用小動(dòng)物骨密度及體成分分析儀檢測(cè)各組小鼠脛骨骨密度，結(jié)果如圖1所示，200 mg/kg秦皮乙素組骨密度與對(duì)照組相比略有增加，而秦皮乙素400 mg/kg組小鼠脛骨骨密度明顯高于對(duì)照組。

圖1 各組小鼠脛骨骨密度比較Fig.1 Bone mineral density of the tibia in each group

2.2 秦皮乙素對(duì)骨組織形態(tài)的影響

取小鼠脛骨組織做石蠟切片與HE染色，結(jié)果如圖2所示，10月齡對(duì)照組小鼠骨髓腔中骨小梁大量丟失，充斥著大量脂肪細(xì)胞；而秦皮乙素200 mg/kg組小鼠脛骨中可見(jiàn)少量骨小梁，但仍有大量脂肪細(xì)胞；秦皮乙素400 mg/kg組小鼠脛骨中骨小梁數(shù)量與對(duì)照組相比明顯增多，僅見(jiàn)少量脂肪細(xì)胞。以上結(jié)果說(shuō)明秦皮乙素可以延緩小鼠骨量丟失。

2.3 秦皮乙素影響B(tài)MSCs礦化結(jié)節(jié)形成能力

分離BMSCs細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)28 d后進(jìn)行茜素紅染色，染色結(jié)果顯示秦皮乙素400 mg/kg組BMSCs的礦化結(jié)節(jié)明顯多于對(duì)照組，而200 mg/kg組與對(duì)照組相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3，提示秦皮乙素促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成能力。

2.4 秦皮乙素對(duì)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因表達(dá)的影響

圖4 秦皮乙素對(duì)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of esculetin on the expression of osteoblast differentiation marker genes

分離BMSCs細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果如圖4所示，秦皮乙素劑量依賴地促進(jìn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因ALP、BSP、Col1與Runx2的表達(dá)。同時(shí)對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)靶基因Dkk1與轉(zhuǎn)錄因子Lef1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秦皮乙素同樣促進(jìn)Dkk1與Lef1的表達(dá)，此結(jié)果提示秦皮乙素可能通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)調(diào)控成骨細(xì)胞分化。

3 討論

女性較男性更易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，因?yàn)榻^經(jīng)后的婦女雌激素缺乏，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分泌核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，使骨吸收加速，而骨形成沒(méi)有相應(yīng)增加，最終引起骨小梁結(jié)構(gòu)改變，骨脆性增加[6-7]。因此，雌激素缺乏引起骨重建負(fù)平衡，使骨量丟失加重，是骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要原因。盡管雌激素對(duì)于提高骨密度、降低骨折風(fēng)險(xiǎn)有很好的療效，但是長(zhǎng)期使用雌激素提高了患乳腺癌、子宮出血與心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。對(duì)于非雌激素缺乏引發(fā)的增齡性骨質(zhì)疏松癥的治療仍是一項(xiàng)任重而道遠(yuǎn)的工作。C57BL/6小鼠骨量在4～8個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰，隨后隨著年齡增大骨量逐漸丟失，類似于增齡性骨質(zhì)疏松癥[10-11]。本研究利用C57BL/6小鼠構(gòu)建增齡性骨質(zhì)疏松癥模型，選取骨密度高峰期7月齡進(jìn)行干預(yù)，避免了雌激素的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 mg/kg秦皮乙素組小鼠脛骨骨密度雖有略微增加，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且BMSCs礦化結(jié)節(jié)形成能力也并未見(jiàn)明顯增強(qiáng)。秦皮乙素400 mg/kg能顯著延緩小鼠的骨量丟失，10月齡時(shí)與對(duì)照組相比，骨小梁數(shù)量明顯增多，且脂肪空泡減少。

目前應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的藥物主要為西藥，但這類藥物多數(shù)具有嚴(yán)重或潛在的不良反應(yīng)，如長(zhǎng)期使用雙膦酸鹽會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨失常、肌肉疼痛與骨折[12-13]。中藥及天然藥物在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?duì)傳統(tǒng)中藥進(jìn)行2次開(kāi)發(fā)，特別是開(kāi)發(fā)有效部位制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)易于和國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)接軌，是中藥現(xiàn)代化發(fā)展的趨勢(shì)之一。本研究中的秦皮乙素是一類廣泛存在于自然界植物中的香豆素類化合物，容易獲得，且具有安全無(wú)毒副作用，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持生理狀態(tài)骨代謝平衡具有關(guān)鍵作用，目前臨床治療骨質(zhì)疏松策略是抑制骨吸收，而針對(duì)骨形成的靶點(diǎn)藥物尚未有很好的應(yīng)用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)秦皮乙素通過(guò)調(diào)控NFATc1與c-Fos的表達(dá)影響破骨細(xì)胞分化與功能[5]。本研究發(fā)現(xiàn)秦皮乙素可以劑量依賴性地促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成能力，同時(shí)提高成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因ALP、BSP、Col1與Runx2的表達(dá)，提示秦皮乙素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化能力，對(duì)于骨形成靶點(diǎn)藥物的研發(fā)具有一定的提示作用。

Wnt信號(hào)通路是生物體內(nèi)廣泛存在的信號(hào)通路，激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路引起β-actin蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定、積累并進(jìn)入細(xì)胞核，增加下游淋巴樣增強(qiáng)因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，Lefl)和T細(xì)胞因子(T cell factors，TCF)等轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄[15]。因此經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在胚胎的骨骼發(fā)育和個(gè)體的骨量維持方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)秦皮乙素劑量依賴性地增加了BMSCs細(xì)胞中經(jīng)典Wnt信號(hào)的靶基因Lef1與Dkk1的表達(dá)，因此筆者猜測(cè)秦皮乙素可能參與調(diào)控經(jīng)典Wnt信號(hào)。

綜上，本研究利用增齡性骨質(zhì)疏松癥小鼠模型發(fā)現(xiàn)秦皮乙素可能通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而延緩骨量丟失，但詳細(xì)的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究，因此開(kāi)發(fā)新的治療骨質(zhì)疏松癥藥物仍是一項(xiàng)任重而道遠(yuǎn)的工作。