許勇,李靜,蔡標(biāo),王紅萍,戴陳偉,王娟
安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 微生物研究所,安徽 合肥 230061
貝母是傳統(tǒng)的藥用植物,其鱗莖入藥具有止咳化痰、清熱散結(jié)等功效,在我國(guó)主要分布于四川、新疆、甘肅、湖北、安徽、浙江等省區(qū)[1-2],包括川貝母、浙貝母、暗紫貝母、皖貝母等多個(gè)品種。貝母甲素、貝母乙素、爐貝甲素、川貝酮和西貝素等5α-瑟文類異甾體生物堿是貝母的主要生物活性成分[2]。
環(huán)阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)屬于氧化鯊烯環(huán)化酶(oxido squalene cyclase,OSC)家族,能夠催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成環(huán)阿屯醇,不僅是植物甾醇合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶,同時(shí)又是三萜類物質(zhì)合成的重要調(diào)控位點(diǎn)[3]。研究表明,貝母甲素等生物堿與萜類化合物合成途徑相似,都屬于甲羥戊二酸(mevalonic acid,MVA)途徑,因此,CAS也是貝母素甲等生物堿的合成途徑中的關(guān)鍵酶[4]。
應(yīng)用生物信息學(xué)手段,分析預(yù)測(cè)藥用植物中生物活性物質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能,在對(duì)其生物合成機(jī)制的研究中得到廣泛應(yīng)用。已有學(xué)者用生物信息學(xué)手段對(duì)紅花中的查爾酮合成酶[5]和金銀花綠原酸合成酶[6]進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析,探究其生物活性物質(zhì)的合成機(jī)制。
本研究旨在通過(guò)ProtParam、SignalP4.1、Scan-Prosite、ProtScale和SWISS-MODEL等生物信息學(xué)手段,分析預(yù)測(cè)貝母中環(huán)阿屯醇合酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能,為進(jìn)一步研究貝母活性生物堿的生物合成調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
浙貝母(Fritillaria thunbergii)環(huán)阿屯醇合成酶(FtCAS)氨基酸序列下載自NCBI網(wǎng)站(Gen-Bank登錄號(hào):AEO27878)。
利用ProtParam分析浙貝母環(huán)阿屯醇合成酶的理化性質(zhì),SignalP[7]預(yù)測(cè)信號(hào)肽,PSORT預(yù)測(cè)細(xì)胞亞定位,TMHMM進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析,ProtScale預(yù)測(cè)親疏水性[8],SOMPA預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)[9],Predict-Protein[10]預(yù)測(cè)二硫鍵,PROSITE預(yù)測(cè)功能位點(diǎn),COILS[11]預(yù)測(cè)卷曲螺旋,SWISS-MODEL[12-16]進(jìn)行同源建模,用MolProbity軟件中的Ramachandran[17]對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,3DLigandSite[18]預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)。
ProtParam分析結(jié)果顯示FtCAS由756個(gè)氨基酸殘基組成(表1),其中比例最高的為L(zhǎng)eu(9.5%),比例最低的為Cys(2.4%)。FtCAS的相對(duì)分子質(zhì)量為85 507.69,理論等電點(diǎn)(pI)為6.02,帶負(fù)電氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為82,帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為69,半衰期大于20 h,不穩(wěn)定系數(shù)36.85,總平均親水系數(shù)為-0.223,是穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。
表1 FtCAS的氨基酸組成
通過(guò)SignalP4.1 Server分析發(fā)現(xiàn),F(xiàn)tCAS的自然分裂位點(diǎn)分值(C-Score)的峰值為0.118(第38位),組合分裂位點(diǎn)分值(Y-Score)的峰值為0.123(第12位),不存在信號(hào)肽(圖1)。PSORT細(xì)胞亞定位預(yù)測(cè)FtCAS位于細(xì)胞質(zhì)中的微體或過(guò)氧化物酶體。應(yīng)用TMHMM Server v.2.0對(duì)FtCAS進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析(圖2),發(fā)現(xiàn)該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域(TMHs),非跨膜螺旋區(qū)(ExpAA)為 15.8607(<18),預(yù)測(cè)表明該蛋白非跨膜蛋白;蛋白的N端位于膜內(nèi)側(cè)的概率為0.029 74,該序列總體位于膜外。通過(guò)ProtScale對(duì)FtCAS的氨基酸序列的親疏水性進(jìn)行在線預(yù)測(cè),多肽鏈中的第126位脯氨酸的疏水值為1.944,是疏水性最強(qiáng)的氨基酸,第358位谷氨酸的疏水值為-2.778,是親水性最強(qiáng)的氨基酸。N端和C端都是負(fù)值,都顯親水性,整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數(shù)多于疏水性氨基酸殘基(圖3),可以預(yù)測(cè)FtCAS為可溶性親水蛋白。
圖1 SignalP4.1預(yù)測(cè)FtCAS的信號(hào)肽
圖2 TMHMM分析FtCAS的跨膜性
圖3 ProtScale預(yù)測(cè)FtCAS的親疏水性
利用SOMPA對(duì)FtCAS的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α螺旋占43.92%(332個(gè)氨基酸殘基),延伸鏈結(jié)構(gòu)占13.76%(104個(gè)氨基酸殘基),β轉(zhuǎn)角占7.14%(54個(gè)氨基酸殘基),無(wú)規(guī)卷曲占35.19%(266個(gè)氨基酸殘基)。α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲是FtCAS二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成原件。
PredictProtein預(yù)測(cè)結(jié)果表明FtCAS中不存在二硫鍵;PROSITE蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)萜類合酶位點(diǎn)(603~617 aa),其氨基酸序列為DGSWYGSWAVCFTYG。
如表2所示,通過(guò)COILS分析,發(fā)現(xiàn)FtCAS在Window=14時(shí)卷曲概率最高,為0.142,小于0.5,所以FtCAS不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。
表2 COILS預(yù)測(cè)的最高傾向性氨基酸區(qū)段
如表3和圖4,SWISS-MODEL建模以PDB ID1w6j.1的A鏈為模板,序列一致性為50.16%,相似度0.44,覆蓋度0.84,功能預(yù)測(cè)為羊毛甾醇合成酶。模型的總體評(píng)價(jià)為0.69,Qmean為-2.60。Ramachandran評(píng)估結(jié)果表明同源建模顯示氨基酸位點(diǎn)都位于最佳區(qū)域內(nèi)的占94.8%(614/648),氨基酸位點(diǎn)位于允許區(qū)域范圍內(nèi)的占98.5%(638/648),說(shuō)明所建三級(jí)結(jié)構(gòu)模型均準(zhǔn)確可靠(圖5)。3DLigandSite以PDB ID 1w6k的A鏈為折疊子,預(yù)測(cè)得到FtCAS的結(jié)合配體為 Zn2+,結(jié)合位點(diǎn)為 676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala(圖6)。
表3 FtCAS同源建模及功能預(yù)測(cè)
圖4 SWISS-MODEL對(duì)FtCAS三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
圖5 MolProbity Ramachandran分析FtCAS的三級(jí)結(jié)構(gòu)
圖6 3DLigandSite預(yù)測(cè)FtCAS配體結(jié)合位點(diǎn)圖中藍(lán)色部分為配體結(jié)合位點(diǎn)
FtCAS整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數(shù)多于疏水性氨基酸殘基,其二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲,有助于保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,總體來(lái)說(shuō),F(xiàn)tCAS是穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。根據(jù)信號(hào)肽分析、亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),F(xiàn)tCAS是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微體中的非分泌蛋白,和其所催化的MVA途徑反應(yīng)場(chǎng)所一致[19],這也證明了預(yù)測(cè)的可靠性。
FtCAS中不含二硫鍵,這可能是由于其Cys殘基含量低并且在催化功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)主要與分子識(shí)別、細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能相關(guān)[21],F(xiàn)t-CAS中不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)也不發(fā)揮上述功能。
萜類合酶是萜類合成的核心酶,其催化產(chǎn)物多為環(huán)狀,又稱環(huán)化酶[22]。FtCAS的603~617 aa區(qū)域被預(yù)測(cè)為功能位點(diǎn),發(fā)揮萜類合酶作用,與該酶的功能相符。萜類合酶的催化過(guò)程需要金屬離子作為輔助因子[22],F(xiàn)tCAS的輔助因子可能為 Zn2+,結(jié)合位點(diǎn)為676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala。
CAS和羊毛甾醇合成酶的催化底物都是2,3-氧化鯊烯,產(chǎn)物環(huán)阿屯醇和羊毛甾醇為同分異構(gòu)體,催化過(guò)程中2,3-氧化鯊烯都會(huì)經(jīng)歷“椅-船-椅”構(gòu)象,產(chǎn)生C-20原甾醇陽(yáng)離子中間體,并進(jìn)行骨架重組,最終生成終產(chǎn)物[3]。因此,SWISSMODEL和3DLigandSite都以羊毛甾醇合成酶為模板,建立FtCAS的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)FtCAS的分析預(yù)測(cè)結(jié)果與其實(shí)際功能有很強(qiáng)的聯(lián)系,證明預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性較高,可以以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探討貝母中生物堿合成的調(diào)控機(jī)制。