陳瑜麗，張晶晶，馬艷，盧雪梅，劉文彬 ，金小寶 ，汪潔

1.廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

肝靶向肽CSP I-plus是從瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白（circumsprozoite protein，CSP）中篩選得到的能夠特異識(shí)別并黏附在肝細(xì)胞表面的多肽序列。肝靶向肽能與肝細(xì)胞表面受體硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）特異性結(jié)合，將具有藥物活性的物質(zhì)富集于肝臟部位，發(fā)揮其生物學(xué)功能[1-2]。黑色素瘤分化相關(guān)基因 7（melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7）是Fisher等[3-4]于1995年發(fā)現(xiàn)的具有細(xì)胞因子樣特性的腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白具有廣譜抗腫瘤活性，有強(qiáng)大的“腫瘤特異性旁觀者效應(yīng)”，可對(duì)周圍甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，對(duì)控制腫瘤復(fù)發(fā)具有重要的臨床意義，但對(duì)正常細(xì)胞無任何毒性[5-9]。后來發(fā)現(xiàn)MDA-7與白細(xì)胞介素10（IL-10）細(xì)胞因子家族基因具有同源性和親緣關(guān)系，屬于IL-10家族，因此，2001年被重新命名為白細(xì)胞介素24（IL-24）。研究表明，MDA-7/IL-24在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，其表達(dá)水平與腫瘤大小、病理分級(jí)和血清甲胎蛋白（AFP）呈明顯的負(fù)相關(guān)，且隨著肝癌惡性程度的增加表達(dá)水平減少或缺失[10]?；诟伟邢蚝涂鼓[瘤的雙重作用，本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了肝靶向肽-抗腫瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）融合基因，期望用于肝癌術(shù)后治療，減少術(shù)后復(fù)發(fā)率和提高生存率。如何獲得大量重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24以滿足其開發(fā)應(yīng)用和研究須進(jìn)一步探索。我們對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度各選取5個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行條件優(yōu)化，為重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24的規(guī)?；a(chǎn)和活性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24由廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌表達(dá)載體pET21b及大腸桿菌BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存。丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、TEMED（BioRad公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）；異丙基-β-D-硫代半糖（IPTG）（Sigma公司）；氨芐青霉素（Amp）（Amresco公司）；蛋白預(yù)染marker（Fermentas公司）。

1.2 重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24的構(gòu)建

將CSP-MDA-7/IL-24融合基因的PCR產(chǎn)物純化后，分別用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切重組克隆載體CSP-MDA-7/IL-24和質(zhì)粒表達(dá)載體pET21b，用T4DNA連接酶將克隆載體雙酶切得到的小片段與質(zhì)粒pET21b連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pET21b-CSP-MDA-7/IL-24，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化菌種涂于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18 h，獲得重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24。

1.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

接菌環(huán)取一環(huán)重組菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24甘油種子劃在LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，按體積比 1∶100接入LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，此時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8和 9 h各取1 mL菌液測(cè)定D600nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600nm值為縱坐標(biāo)，繪制表達(dá)菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24的生長(zhǎng)曲線，以研究其生長(zhǎng)規(guī)律，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

1.4 單因素分析誘導(dǎo)表達(dá)條件

1.4.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 將培養(yǎng)過夜的重組菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24菌液加到 300 mL 含 100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，體積比為1∶100，37℃搖床培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6、7和8 h取樣，4℃、12 000 r/min離心5 min收集各樣品中的菌體，分別加入160 μL 1×Tris-HCl和 40 μL 5×SDS 上樣緩沖液，充分混勻后沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.4.2 培養(yǎng)基pH值對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 將培養(yǎng)過夜的重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按體積比1∶100加到pH值分別為4、5、6、7、8、9和10的含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，分別加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，振蕩培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的最佳培養(yǎng)pH值范圍。

1.4.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 將培養(yǎng)過夜的重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24按體積比1∶100分別加到含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，分別加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，分別于17、22、27、32、37、42℃振蕩培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度。

1.4.4 誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 將培養(yǎng)過夜的重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按體積比1∶100分別加到含100 μg/mL Amp的 LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為 0.00、0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑IPTG濃度。

1.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件

根據(jù)單因素分析結(jié)果，用正交設(shè)計(jì)助手V3.1設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L25（45），以不同誘導(dǎo)時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、不同培養(yǎng)基pH值（6、6.5、7、7.5、8）、不同誘導(dǎo)溫度（32、34.5、37、39.5、42℃）和不同誘導(dǎo)劑IPTG 濃度（0.03、0.06、0.12、0.25、0.50 mmol/L）四因素五水平進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，研究BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌高水平表達(dá)的規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重組菌株的生長(zhǎng)曲線分析

生長(zhǎng)曲線反映了工程菌的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)，可以確定該重組菌株在某一時(shí)刻所處的生長(zhǎng)階段，依此為依據(jù)，選擇合適的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)。由BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重組菌株的生長(zhǎng)曲線（圖1）可見，培養(yǎng)2～3 h時(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

圖1 重組菌株BL21/p ET21b-CSP-MDA-7/IL-24的生長(zhǎng)曲線

2.2 單因素分析誘導(dǎo)表達(dá)條件

2.2.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 首先考察了不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CSP-MDA-7/IL-24融合基因表達(dá)的影響。結(jié)果見圖2，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)量也在逐漸增加，在加入IPTG誘導(dǎo)4 h后，重組蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰，占菌體總蛋白的49.5%。但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，雜蛋白也在不斷增加，所以4 h為誘導(dǎo)最佳時(shí)間。

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)蛋白的SDS-PAGE

2.2.2 培養(yǎng)基pH值對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 對(duì)培養(yǎng)基不同pH值的考察結(jié)果見圖3，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下，培養(yǎng)基pH值為6～8時(shí)適宜CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)，pH值為7.0時(shí)目的蛋白表達(dá)達(dá)高峰，占菌體總蛋白的89.6%。

圖3 培養(yǎng)基不同pH值時(shí)重組菌

2.2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 誘導(dǎo)溫度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白的表達(dá)有很大影響。如圖4所示，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下，培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)含量占菌體總蛋白的54%，均高于其他溫度。

圖4 不同誘導(dǎo)溫度時(shí)重組菌

2.2.4 誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響 誘導(dǎo)劑IPTG通過誘導(dǎo)pET原核表達(dá)載體中的lacUV5啟動(dòng)子來過量表達(dá)T7RNA聚合酶，從而增加目的蛋白的表達(dá)。IPTG濃度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的影響如圖5所示，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下，IPTG濃度為0.12 mmol/L時(shí)，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)含量占菌體總蛋白的25.2%。

圖5 不同IPTG濃度時(shí)重組菌

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化表達(dá)條件

正交設(shè)計(jì)是一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)，能夠研究多因素不同水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。通過正交試驗(yàn)分析影響重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)外源蛋白的主要因素，能夠提高目的蛋白的表達(dá)量。通過正交試驗(yàn)L25（45）對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度共四因素五水平進(jìn)行優(yōu)化（參數(shù)水平見表1）。圖6為正交試驗(yàn)不同條件下目的蛋白的表達(dá)結(jié)果，正交分析軟件分析四因素五水平對(duì)蛋白表達(dá)量的影響如表2（正交試驗(yàn)結(jié)果與分析）、表3（方差分析）。結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度是CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的主要影響因素，具有顯著性差異；誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值和誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響較小，無顯著差異。綜合分析，42℃誘導(dǎo)4 h，培養(yǎng)基pH值為7.0，IPTG濃度為0.12 mmol/L，是CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的最佳條件。背景清楚等優(yōu)點(diǎn)的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)[11-13]。原核系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，不同誘導(dǎo)條件在很大程度上影響目的蛋白的表達(dá)量[14-17]。本實(shí)驗(yàn)中，融合基因CSP-MDA-7/IL-24在大腸桿菌BL21/pET21b表達(dá)

表1 正交實(shí)驗(yàn)選取因素及其水平

圖6 SDS-PAGE分析正交試驗(yàn)各條件下目的蛋白的表達(dá)量

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)軟件方差分析各因素對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

蛋白質(zhì)藥物憑借其活性高、特異性強(qiáng)、毒性低、生物功能明確和有利于臨床應(yīng)用等特點(diǎn)，已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分。重組蛋白可通過原核表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)等進(jìn)行表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建融合基因CSP-MDA-7/IL-24，選取具有易于培養(yǎng)、繁殖快、表達(dá)量高、成本低、易純化和遺傳載體中被誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白產(chǎn)物以包涵體的形式存在，有利于目的蛋白的進(jìn)一步提純。

研究表明，細(xì)菌生長(zhǎng)速率對(duì)外源蛋白表達(dá)有很大影響。為提高目的蛋白表達(dá)效率，我們通過測(cè)定重組菌株的生長(zhǎng)曲線，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。單因素分析確定最適培養(yǎng)基pH值、最佳誘導(dǎo)溫度、最佳誘導(dǎo)時(shí)間和最適誘導(dǎo)劑IPTG濃度，并在此基礎(chǔ)上各選取5個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，摸索出最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。單因素分析結(jié)果表明，在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間不斷增加，目的蛋白表達(dá)量也在不斷增加，誘導(dǎo)4 h時(shí)達(dá)到濃度高峰。在相同誘導(dǎo)時(shí)間下，SDS-PAGE結(jié)果分析表明，培養(yǎng)基pH為7.0、誘導(dǎo)溫度42℃、不同IPTG濃度下表達(dá)量相當(dāng)。正交試驗(yàn)SDS-PAGE結(jié)果表明，CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白的表達(dá)最佳條件組合為誘導(dǎo)4 h、pH7.0、誘導(dǎo)溫度42℃、IPTG濃度0.12 mmol/L，此時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，達(dá)43.6%。正交分析結(jié)果表明，四因素五水平中，誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)具有顯著性影響，而pH值、溫度和IPTG濃度則無明顯影響。

本研究確定了重組蛋白肝靶向肽-抗腫瘤肽的最佳表達(dá)條件，為深入探討其復(fù)性條件、純化條件、生物學(xué)活性及藥物開發(fā)等提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。