劉愛玲 劉愛勝 吳 敏

輪狀病毒(rotavirus，RV)是1973年首次由澳大利亞Bishop等科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體[1]。RV感染具有普遍性、易感性、易變異及RV血清型多等特點(diǎn)，且不同地區(qū)、不同年份RV流行特征明顯不同，即使同一地區(qū)不同季節(jié)、不同年份RV感染和血清型流行情況也不一樣，甚至同一地區(qū)同一種型別也可能存在多種毒株同時(shí)流行[2]。因此，不同地區(qū)、不同年份加強(qiáng)對(duì)RV感染和血清型流行特征進(jìn)行不定時(shí)監(jiān)測，對(duì)防治RV感染性嬰幼兒腹瀉具有重要意義。本研究對(duì)深圳市龍華區(qū)門診腹瀉嬰幼兒的A組RV感染和G血清型、P血清分型情況進(jìn)行了調(diào)查分析，為防治RV性腹瀉提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年3月在深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院門診就診的1033例腹瀉嬰幼兒的1033份糞便標(biāo)本，其中男性438例，女性595例；年齡0～5歲，平均年齡(2±2.18)歲。按年齡將其分為＜0.5歲組(125例)、0.5～1歲組(492例)、1～3歲組(305例)和＞3歲組(111例)4組。門診嬰幼兒腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)：每日大便次數(shù)增加(≥3次)或大便性狀發(fā)生明顯改變(包括稀水樣、蛋花樣、黏液樣或稀糊樣等)[2-3]。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，并經(jīng)嬰幼兒家長知情同意并簽定知情同意書。

1.2 儀器與試劑

CEQ8800型測序儀及配套試劑由美國Beckman公司提供；瓊脂糖凝膠電泳儀及配套試劑由美國Bio-Rad公司提供；核酸提取試劑盒由美國Qiagen公司提供；RT-聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒由美國Invitrogen公司提供；RV抗原檢測試劑盒由艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司提供。

1.3 檢測方法

(1)標(biāo)本采集。采集門診腹瀉嬰幼兒急性期糞便，置于無菌容器內(nèi)，立即送至檢驗(yàn)科用膠體金免疫層析法進(jìn)行RV抗原檢查，對(duì)A組RV陽性的糞便標(biāo)本用生理鹽水混勻，制成10%的懸液，于-80℃保存，為進(jìn)行RV的G血清型和P血清型分型備用。

(2)RV抗原檢測。采用膠體金免疫層析法對(duì)腹瀉標(biāo)本中RV抗原進(jìn)行檢測，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

(3)RV分型。①RV病毒核酸提取，RV病毒核酸提取嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，在提取的80 μl核酸標(biāo)本中加入RNA酶抑制劑1.5 μl(40 U/μl)，于-80 ℃保存?zhèn)溆茫虎谝镞x擇，采用套式PCR對(duì)RV病毒進(jìn)行G血清型和P血清型分型。

(4)G血清型分型。一次放大采用編碼VP7基因兩端的保守序列設(shè)計(jì)引物(正鏈引物9Con1，負(fù)鏈引物9Con2)，放大基因的全長序列，二次放大正鏈引物選擇基因的不同血清型的特征設(shè)計(jì)一組分型引物(9T1、9T2、9T3、9T4、9T9B)，正鏈引物為基因5’端保守序列的公用引物(9Con1)。這樣從放大產(chǎn)物的特征分子量大小即可區(qū)別RV樣品的不同血清型[4]。

(5)P血清型分型。引物設(shè)計(jì)原理與G血清型分型類似，一次放大引物(4Con3和4Con2)選擇在VP4基因的高保守序列，二次放大負(fù)鏈引物選擇一次放大基因區(qū)段內(nèi)不同血清型的特征序列，設(shè)計(jì)一組分型引物(1T1、2T1、3T1、4T1、5T1)，正鏈引物仍采用5’端的公用引物(4Con3)，引物由美國Invitrogen公司合成[5]。引物序列見表1。

(6)巢式PCR。采用RT-PCR法對(duì)提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為模板RNA 1 μl，2×Reaction Mix(containing 0.4 mmol/L of each dNTP，3.2 mM MgSO)5 μl，引物0.15 μmol/L，SurperScriptTMⅢ RT/Platium Taq Mix 0.4 μ l， RNase inhibitor0.05 μl，總體積10 μl。

(7)RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)條件為50 ℃30 min→94 ℃ 10 min，然后94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→68 ℃2 min，反復(fù)循環(huán)35次后于68 ℃延伸5 min。將RTPCR產(chǎn)物稀釋100～10 000倍后進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→68 ℃90 s，反復(fù)運(yùn)行25個(gè)循環(huán)后于68 ℃延伸7 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，組間比較采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A組RV感染情況

在1033份門診嬰幼兒腹瀉標(biāo)本中共檢出A組RV抗原436份，陽性率為42.21%(436/1033)，其中男性為44.06%(193/438)，女性為40.84%(243/595)，男性略高于女性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.032，P＞0.05)。

2.2 不同年齡嬰幼兒A組RV感染情況

0.5～1 歲組嬰幼兒A組RV感染率最高，陽性率為61.18%，明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.762，P＜0.05)，其次為1～3歲組，陽性率為33.11%，見表2。

表1 A組輪狀病毒G和P分型引物序列情況

表2 不同年齡腹泄嬰幼兒A組RV感染情況

表3 腹泄嬰幼兒A組RV感染季節(jié)分布情況

2.3 A組RV感染季節(jié)分布情況

每年第4季度A組RV感染率最高，陽性率為53.54%，略高于1季度的47.99%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.032，P＞0.05)，但明顯高于其他兩個(gè)季度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.135，x2=5.415；P＜0.05)，見表3。

2.4 A組RV的G血清型分布情況

4 3 6 例R V陽性標(biāo)本中G 3血清型檢出率最高，為53.21%(232/436)，明顯高于G1血清型的31.42%(137/436)、G2血清型的2.75%(12/436)、G4血清型的2.06%(9/436)和G9血清型的1.61%(7/436)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.854，x2=6.751，x2=11.582，x2=19.192；P＜0.05)。不同G血清型混合感染率為4.59%(20/436)，且以混合感染G3G1血清型為主，占55.0%(11/20)。不能確定G血清型有19例，占4.36%。

2.5 A組RV的P血清型分布情況

436例RV陽性標(biāo)本P[8]血清型檢出率最高，陽性率為79.82%(348/436)株，明顯高于P[1]血清型的5.28%(23/436)、P[4]血清型的2.52%(11/436)、P[9]血清型的1.83%(8/436)及P[6]血清型的1.61%(7/436)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=27.025，x2=31.635，x2=40.924，x2=49.516；P＜0.05)。不同P血清型混合感染率3.90%(17/436)。未知P血清型22株，占5.05%(22/436)。

2.6 A組RV的G血清和P血清型混合感染情況

RV的G和P血清型混合感染主要見于G3P[8]和G1P[8]血清型，陽性率分別為43.58%(190/436)和28.90%(126/436)，其次為G2P[8]血清型和G3G1P[8]血清型。此外，還檢測到其他較少見的混合感染株，見表4。

表4 腹泄嬰幼兒不同RV的G和P血清型混合感染情況

2.7 凝膠電泳分析

取3～8 μl的PCR產(chǎn)物，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(60 min/120 V)，并采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，如圖1、圖2所示。

圖1 輪狀病毒RT-PCR特異性產(chǎn)物電泳圖

圖2 RV PCR陽性產(chǎn)物測序圖

3 討論

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，以及人們生活水平的提高及衛(wèi)生習(xí)慣的改善，細(xì)菌性腹瀉得到了有效控制，而病毒性感染成為全球嬰幼兒急性腹瀉的重要原因[6]。RV感染性腹瀉是嬰幼兒常見疾病之一，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉和嘔吐，各個(gè)年齡段均有發(fā)生，主要易發(fā)于兒童、老年人、旅游者及免疫受抑制者， 尤其是嬰幼兒，不僅發(fā)病率高，而且是嬰幼兒死亡的主要原因之一，僅次于肺炎排在第2位[7]。2008年據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，RV感染造成約45萬幼嬰兒死亡，其中大約90%RV感染死亡病例發(fā)生在亞洲和非洲，我國每年約4萬嬰幼兒死于RV感染性腹瀉[8-9]。目前，尚無治療RV感染性嬰幼兒腹瀉的特效方法，主要采用對(duì)癥治療，糾正脫水和維持電解質(zhì)平衡。因此，監(jiān)控和預(yù)防RV感染具有重要意義[10]。

不同地區(qū)和不同年份A組RV感染率差別相差很大，國內(nèi)外大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)A組RV感染率處于31%～68%之間，且不同性別嬰幼兒之間感染率差異不大。本研究結(jié)果顯示，2016年1月至2017年3月深圳龍華區(qū)門診腹瀉嬰幼兒A組RV感染率為42.21%，明顯低于王瓊等[11]報(bào)導(dǎo)2007-2009年深圳地區(qū)的52.5%，而明顯高于徐丹等[12]報(bào)導(dǎo)2010-2013年深圳南山區(qū)的30.35%和盧麗娟等[13]報(bào)導(dǎo)2008-2011年上海地區(qū)的36.0%，這可能與不同地區(qū)和年份研究嬰幼兒年齡大小、檢測方法、生活水平、接種疫苗、預(yù)防知識(shí)宣傳及標(biāo)本收集的季節(jié)性等原因存在很大差異有關(guān)。且不同性別嬰幼兒RV感染率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與該年齡的嬰幼兒免疫力、生活方式及基礎(chǔ)生理等因素相差不大有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，A組RV好發(fā)0.5～1歲組，其感染率明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國內(nèi)外大部分研究結(jié)果相一致[4-14]。這可能與此時(shí)嬰幼兒從母體獲得被動(dòng)免疫能力逐漸消耗完，而自體主動(dòng)免疫尚未完全成熟，對(duì)各種病原感染的特異性IgM抗體產(chǎn)生不足等有關(guān)外，還與該年齡段嬰幼兒已經(jīng)添加輔食，人工喂養(yǎng)，腸道局部分泌型IgA(sIgA)減少，較易感染各類病原體等有關(guān)。＜6個(gè)月的嬰幼兒感染率較低，這可能與該年齡段的嬰兒大多處于母乳喂養(yǎng)期，乳汁中大量sIgA可以起到保護(hù)其腸道黏膜的作用及從母體獲得被動(dòng)免疫能力尚在等因素有關(guān)。2歲以上的嬰幼兒RV感染率逐漸下降，這可能與嬰幼兒自身sIgA增高、自體主動(dòng)免疫逐漸成熟及抵抗力逐漸增強(qiáng)等因素有關(guān)。因此，加強(qiáng)飲食和環(huán)境衛(wèi)生、切斷傳播途徑、提高兒童主動(dòng)免疫水平是預(yù)防RV感染性嬰幼兒腹瀉重要環(huán)節(jié)。

目前，全球全年均可發(fā)生RV感染，但發(fā)病高峰多為溫帶地區(qū)的秋冬季節(jié)，具有明顯的季節(jié)性，與溫度變化有密切關(guān)系[15]。本研究結(jié)果顯示，A組RV好發(fā)于每年的第4季度和第1季度，明顯高于其他兩個(gè)季度，與國內(nèi)外大部分文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相一致[15-16]。這可能與第4季度和第1季度天氣寒冷、溫差大、嬰幼兒容易著涼及寒冷干燥天氣有利于A組RV生長繁殖等因素有關(guān)。

A組RV的外衣殼蛋白VP4和VP7基因，具有型特異性抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性中和抗體，同時(shí)也作為RV血清基因型的分型依據(jù)。根據(jù)A組RV的VP7和VP4核酸序列差異可分為27種G基因型和35種P基因型，且G和P血清型可自由組合形成混合感染[11]。因此，不同地區(qū)、不同年份A組RV的G和P型別及組合均可能不一致，形成RV復(fù)雜多變的分子流行特征。本研究結(jié)果顯示，2016年1月至2017年3月A組RV的G血清型以G3和G1感染為主，陽性率分別為53.21%和31.42%，而P血清型以P[8]感染為主，陽性率為79.82%，其次為P[1]型，陽性率為5.28%，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相一致[11-16]。但混合感染類型較上述文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的要復(fù)雜一些，產(chǎn)生了3種甚至4種血清型混合感染，主要以G3P[8]和G1P[8]為主，陽性率分別為43.58%和28.90%，其次為G2P[8]和G3G1P[8]，這可能與A組RV治療藥物和口服疫苗的不斷使用，導(dǎo)致A組RV不斷發(fā)生變異有關(guān)。

A組RV是門診嬰幼兒腹瀉主要病原體之一，好發(fā)于每年第4季度和第1季度的0.5～1歲嬰幼兒，且血清型混合感染類型越來越復(fù)雜。目前缺乏針對(duì)RV感染的特效藥物，接種RV疫苗是預(yù)防RV感染最有效方法，但不同血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)作用，不同地區(qū)、不同年份A組RV感染率及血清型流行具有很大差異性，并不斷出現(xiàn)一些新流行毒株，在一定程度地妨礙了接種RV疫苗的效果[17]。因此，不同地區(qū)或同一地區(qū)不同年份對(duì)A組RV感染和血清型流行情況進(jìn)行不定時(shí)監(jiān)測，對(duì)防治RV感染及疫苗的改進(jìn)和推廣具有重要的意義。