劉海濤, 汪承潤, 劉 玲, 柳云云, 葉 蘊, 羅康康

(淮南師范學院生物工程學院, 安徽 淮南 232038)

碳納米管(CNTs)是當前廣泛生產(chǎn)和使用的3大納米材料之一,已應用于眾多領(lǐng)域[1]。由于CNTs持續(xù)的開發(fā)、生產(chǎn)和應用,致使其不可避免地釋放到環(huán)境中,其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化以及進入環(huán)境后的毒性效應和健康風險已越來越引起人們的關(guān)注[2]。植物作為生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分,對CNTs存在潛在的累積效應,被認為是CNTs進入生物循環(huán)的重要途徑[3-4]。因此,研究CNTs對植物的生理生化毒性對于評價其生態(tài)安全性至關(guān)重要。

一般來說,按照所含石墨烯片的層數(shù)可將CNTs分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。相對于SWCNTs,MWCNTs更易制取且用途更為廣泛。因此人們更為關(guān)注MWCNTs的生態(tài)安全性。研究表明,MWCNTs對動物[2,5]、植物[3-4,6-7]、微生物[8-9]、人體[10-11]均會產(chǎn)生有害作用。CNTs的表面功能化可以改變材料本身的化學和物理學特性,使其可以更好地分散于介質(zhì)中,并具有更佳親水性、穩(wěn)定性和生物相容性,從而增強材料本身的工業(yè)化應用潛力[12]。因此,作為CNTs表面功能化的典型代表,羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)比MWCNTs具有更廣的市場應用前景,其進入環(huán)境后可能導致的潛在生態(tài)風險性更值得關(guān)注。

由于具有高比表面積,CNTs進入環(huán)境后往往會成為其他污染物的載體,并對其毒性產(chǎn)生影響[13-14]。重金屬污染是一個世界范圍內(nèi)的生態(tài)、環(huán)境和健康問題,在多數(shù)污染區(qū)域能夠同時檢測到1種以上重金屬,因此,自然環(huán)境中的植物往往暴露于多種重金屬的復合污染中。已有研究證明,CNTs具備吸附重金屬的能力,并能夠增強重金屬離子向植物細胞內(nèi)部的滲透[14]。在CNTs與重金屬復合污染的環(huán)境介質(zhì)中,兩者之間不可避免地會發(fā)生相互作用,進而干擾重金屬的環(huán)境行為和對生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應。然而,國內(nèi)外有關(guān)CNTs復合多種重金屬對植物(包括農(nóng)作物)的生態(tài)風險性的研究仍鮮見報道。因此,研究擬采用蠶豆幼苗作為實驗對象,選取Pb和Cd作為典型重金屬,研究蠶豆幼苗暴露于MWCNTs-COOH、Pb+Cd,以及Pb+Cd+MWCNTs-COOH復合污染溶液后其葉片組織活性氧(ROS)、抗氧化酶活性及其同工酶圖譜、蛋白羰基化產(chǎn)物(氧化損傷蛋白)、熱休克蛋白70 (HSP70)、內(nèi)肽酶(EP)同工酶活性以及非蛋白巰基(NPT)的變化,以期為早期診斷和科學評價MWCNTs與Pb、Cd復合污染的生態(tài)風險性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MWCNTs-COOH

MWCNTs-COOH (純度w>95%,羧基質(zhì)量分數(shù)w為2.56%;內(nèi)徑范圍3～5 nm;外徑范圍8～15 nm;長度0.5～50 μm;比表面積233 m·g-2;灰分w<1.5%;電導率>100 S·m-1)購自中國科學院成都有機化學研究所。使用前對其進行6次間歇式超聲萃取處理〔30 s·(2 min)-1〕,并利用透射電子顯微鏡(TEM) (JEM-100CX, 日本)對樣品進行表征。在透射電子顯微鏡下MWCNTs-COOH呈管狀結(jié)構(gòu),直徑為(8.97±1.25) nm (圖1)。

圖1 MWCNTs-COOH的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM image of MWCNTs-COOH

1.2 蠶豆幼苗的培養(yǎng)與處理

蠶豆種子(Viciafaba)為淮南當?shù)爻Ｒ娖贩N(青皮豆)。種子用φ=0.1%次氯酸鈉溶液浸沒10 min后用Milli-Q水充分漂洗,室溫浸泡24 h后轉(zhuǎn)移至22 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。種子萌發(fā)后篩選根尖長2 cm左右的幼苗,懸浮培養(yǎng)于Hoagland營養(yǎng)液中[15]。設置如下處理組:對照組(CK, 0.5×Hoagland營養(yǎng)液)、2.5 mg·L-1MWCNTs-COOH(以下簡寫為2.5)、5.0 mg·L-1MWCNTs-COOH(以下簡寫為5.0)、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH(以下簡寫為10.0)、20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd (以下簡寫為Pb+Cd)、Pb+Cd+2.5 mg·L-1MWCNTs-COOH (以下簡寫為Pb+Cd+2.5)、Pb+Cd+5.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (以下簡寫為Pb+Cd+5.0)、Pb+Cd+10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (以下簡寫為Pb+Cd+10.0)。制備MWCNTs-COOH和Pb+Cd母液,應用0.5×Hoagland營養(yǎng)液分別稀釋母液,制備上述各組處理溶液,pH值控制在5.5～5.8之間,Zeta電位控制在(-10.92±1.09) mV(ZetaPALS儀測定)。每劑量組準備3個水槽(長×寬×高:40 cm×30 cm×15 cm),每個水槽懸浮培養(yǎng)6株幼苗。幼苗在營養(yǎng)液中預培養(yǎng)2 d后開始置于不同處理溶液中,培養(yǎng)條件為:白天15 h,22 ℃,光照強度240 μmol·m-2·s-1;夜晚9 h,20 ℃,相對濕度80%。每3 d更換1次各組處理溶液,幼苗處理15 d后(6～8片真葉)取適量等位葉片開展實驗。

1.3 葉片組織超氧自由基和過氧化氫產(chǎn)物的測定

超氧自由基(O2·-)的測定參考汪承潤等[16]的方法。稱取1 g 植物葉片,液氮速凍并立即研磨成粉狀,并在提取液(250 mmol·L-1磷酸緩沖液,pH值8.0,含10 μmol·L-1磷酸吡哆醛,1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA),5 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)中勻漿,離心(離心半徑9.5 cm, 4 ℃,10 000 r·min-1)25 min,上清液用于O2·-測定。分別取1 mmol·L-1NH4Cl和50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.8)各0.5 mL,加入0.5 mL上清液,25 ℃水浴60 min,再分別加入17 mmol·L-1對氨基苯磺酸和7 mmol·L-1α-萘胺各1 mL,25 ℃水浴20 min后測定530 nm處吸光度值(OD530 nm),重復3次。以亞硝酸鈉作為底物,按上述方法制備標準曲線,根據(jù)標準曲線換算出NO2-濃度,再計算出O2·-含量。

過氧化氫(H2O2)含量測定參考李玲等[17]的方法。稱取1 g新鮮葉片,加入5 mL預冷的丙酮,冰浴條件下速磨、勻漿,離心(離心半徑9.5 cm, 4 ℃,12 000 r·min-1)20 min。吸取1 mL上清液,分別加入0.2 mL濃氨水、0.1 mLφ=10%的四氯化鈦-鹽酸溶液混勻。反應5 min后,離心(離心半徑9.5 cm，4 ℃,12 000 r·min-1)15 min,棄上清液。用預冷的丙酮洗滌沉淀2次,再向沉淀中加入3 mL 2 mol·L-1硫酸溶液,待沉淀完全溶解后測定OD412 nm,重復3次。以100 μmol·L-1H2O2-丙酮試劑作為反應底物,按上述方法制備標準曲線,根據(jù)標準曲線計算H2O2含量。

1.4 葉片組織4種抗氧化酶酶活性的測定及同工酶圖譜分析

參照WANG等[18-19]的方法制備粗酶液, 所有操作過程均在0～4 ℃條件下進行。參照BRADFORD[20]的方法測定粗酶液蛋白含量。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)以及過氧化物酶(POD)酶活性參照GARCA-LIMONES等[21]的方法測定。SOD酶活性測定:3 mL反應混合液含1.75 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(PBS溶液, pH值7.8)、0.3 mL 0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、0.3 mL 130 mmol·L-1甲硫氨酸、0.3 mL 750 μmol·L-1NBT、0.3 mL 20 μmol·L-1核黃素和30 μL酶液,以酶液抑制氯化硝基四氮唑藍(NBT)光還原50%的抑制率為1個酶活力單位;CAT酶活性以1 min分解1 μmol H2O2為1個酶活力單位;APX酶活性以1 min氧化1 μmol抗壞血酸為1個酶活力單位;POD酶活性以1 min氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚為1個酶活力單位。重復3次。

SOD、APX、POD和CAT同工酶的電泳和顯色均參考GARCA-LIMONES等[21]的方法進行。應用Bio-Rad Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離酶蛋白,以25 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷(Tris)、192 mmol·L-1甘氨酸(pH值8.3)作為電泳緩沖液,在4 ℃條件下進行電泳。SOD和APX同工酶電泳的分離膠為100 g·L-1,POD同工酶電泳的分離膠為80 g·L-1,CAT分離膠為60 g·L-1,積層膠均為50 g·L-1。每個劑量組做3塊膠。

1.5 蛋白羰基化產(chǎn)物和HSP70的免疫印跡分析

蛋白羰基化產(chǎn)物的免疫印跡參照ROMERO-PUERTAS等[22]的方法并略加改進。50 μL粗酶液與50 μLφ=10% 十二烷基硫酸鈉(SDS)、100 μL 20 mmol·L-12,4-二硝基苯肼(DNPH)/φ=20%三氟乙酸(TFA)混合,空白組用100 μLφ=20%TFA 代替20 mmol·L-1DNPH/φ=20% TFA。室溫下靜置30 min,依次加入100 μL 2 mol·L-1Tris (pH值8.0)/φ=30%甘油/φ=6%β-巰基乙醇和50 μLφ=1%溴酚藍,混勻后上樣,進行SDS-PAGE電泳(10%分離膠,5%積層膠)。半干轉(zhuǎn)印(Bio-Rad, USA)后依次包被一抗(小鼠抗DNPH 單克隆IgE抗體, Sigma-Aldrich, 1∶2 000)和二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgE抗體, Sigma-Aldrich, 1∶40 000)。最后用Supersignal West Femoto Trial Kit發(fā)光試劑盒(Thermo, USA)進行顯色,X光片曝光顯影,Canon數(shù)碼相機拍照。

HSP70的SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting) 方法參照WANG等[18]的方法進行。粗酶提取液與裂解緩沖液(0.5 mol·L-1Tris, pH值6.8,φ=20% 甘油、φ=3% SDS、φ=0.01%溴酚蘭和φ=10%β-巰基乙醇混合后,立即煮沸4 min,冰上冷卻。每孔上樣23.2 μg可溶解性蛋白,同時上樣標準蛋白分子Marker(PageRulerTMprestained protein ladder, #SM0671, Fermentas)。電泳結(jié)束后,通過半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Semi-Dry Transfer System,Bio-Rad)將膠塊上的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜, Amersham Pharmacia)。PVDF膜用φ=5%脫脂奶粉(用pH值為7.5的TBST緩沖液,即50 mmol·L-1Tris、150 mmol·L-1NaCl、φ=0.05% Tween-20配制),室溫下封閉2 h。TBST 緩沖液漂洗后,用小鼠抗-HSP70/HSC70單克隆抗體(1∶5 000)(SPA-820, Stressgen, Victoria, 加拿大)于4 ℃條件下包被8 h。TBST 緩沖液漂洗后,PVDF 膜轉(zhuǎn)移至二抗(1∶25 000)(山羊抗抗鼠IgG HRP, Stressgen, Victoria, 加拿大),于室溫下包被1.5 h。最后用ECL發(fā)光試劑盒(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate)進行發(fā)光,X光片顯影,Canon數(shù)碼相機拍照。

1.6 EP同工酶分析

EP同工酶實驗參照DISTEFANO等[23]的方法進行,略加改進。SDS-PAGE凝膠電泳分離內(nèi)肽酶同工酶, 80 g·L-1分離膠(內(nèi)含φ=0.1%明膠),50 g·L-1積層膠,4 ℃條件下電泳。電泳結(jié)束后,膠塊浸沒于0.1 mol·L-1冰醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值4.5),37 ℃恒溫水浴后轉(zhuǎn)移至250 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.5)中,36 ℃恒溫孵育2 h,再將凝膠轉(zhuǎn)移至顯色液(φ=0.1%考馬斯亮藍R-250/φ=40%甲醇/φ=10%冰乙酸)中,室溫下染色2 h,最后用φ=40%甲醇/φ=10%冰乙酸脫色。EP同工酶為藍色背景下的白色帶型。Canon數(shù)碼相機拍照。

1.7 NPT產(chǎn)物的測定

NPT產(chǎn)物的測定參照RAMA等[24]提出的方法。稱取0.2 g葉片樣品,加5 mLφ=5%磺基水楊酸,冰浴研磨,離心(離心半徑9.5 cm，4 ℃,12 000 r·min-1)15 min, 取上清液并定容至5 mL。反應體系為1 mL上清液、1.85 mL 0.2 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.2)、0.15 mL 10 mmol·L-15,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB),反應20 min后用多功能酶標儀(TECAN Infinite M200)于412 nm處測定吸光度值,以不加DTNB為空白,以還原性谷胱甘肽為標樣,制作標準曲線。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析,單因素方差分析(one-way ANOVA)進行數(shù)據(jù)間的差異顯著性檢驗,若差異顯著(P<0.05),采用Duncan法進行多重比較。采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 O2·-和H2O2含量變化

如圖2所示，與對照組相比,MWCNTs-COOH單一處理組(以下簡稱單一組) O2·-含量呈增加趨勢,其中,5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組誘導了O2-顯著積累(P<0.05);H2O2含量呈先降低后增加的趨勢,其中5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組誘導了H2O2顯著積累(P<0.05)。

CK為對照； 2.5、5.0、10.0分別表示2.5、5.0、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH； Pb+Cd表示20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd。同一幅圖中直方柱上方小寫字母不同表示處理間某指標差異顯著(P<0.05)。

與Pb+Cd處理組相比,MWCNTs-COOH復合Pb+Cd處理組(以下簡稱復合組) O2·-含量呈先降低后增加的趨勢,但各處理組無顯著差異;H2O2含量隨著MWCNTs-COOH的濃度增加而顯著積累(P<0.05)。

MWCNTs-COOH復合組與MWCNTs-COOH單一組相比,O2·-含量在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時,復合組高于單一組;在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0～10.0 mg·L-1時,復合組低于單一組。H2O2含量在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5和10.0 mg·L-1時,復合組高于單一組;在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0 mg·L-1時,復合組低于單一組。

2.2 4種抗氧化酶活性及同工酶圖譜的變化

如圖3所示，與對照組相比,MWCNTs-COOH單一組SOD酶活性呈升高趨勢,5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組誘導了SOD酶活性顯著升高(P<0.05)。CAT和APX酶活性呈先升高后降低的趨勢,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0 mg·L-1時,CAT和APX酶活性最強,其中各單一組CAT酶活性顯著升高(P<0.05),5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組APX酶活性被顯著誘導(P<0.05)。POD酶活性呈先升高后降低的趨勢,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時,POD酶活性最強,其中2.5 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組POD酶活性被顯著誘導(P<0.05)。

與Pb+Cd處理組相比,MWCNTs-COOH復合組SOD和POD酶活性呈先降低后升高的趨勢,其中各復合組SOD酶活性未見顯著性升高(P>0.05),5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復合組誘導了POD酶活性顯著升高(P<0.05)。CAT酶活性呈先升高后降低的趨勢,其中,各復合組CAT酶活性未見顯著性升高。APX酶活性呈升高趨勢,其中5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復合組誘導了APX酶活性顯著升高(P<0.05)。

CK為對照； 2.5、5.0、10.0分別表示2.5、5.0、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH； Pb+Cd表示20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd。同一幅圖中直方柱上方小寫字母不同表示處理間某指標差異顯著(P<0.05)。SOD酶活性以酶液抑制NBT光還原50%的抑制率為1個酶活力單位; CAT酶活性以1 min分解1 μmol H2O2為1個酶活力單位; APX酶活性以1 min氧化1 μmol抗壞血酸為1個酶活力單位; POD酶活性以1 min氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚為1個酶活力單位。

MWCNTs-COOH復合組與MWCNTs-COOH單一組相比,SOD酶活性在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時,復合組高于單一組;在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0～10.0 mg·L-1時,復合組低于單一組。在各濃度MWCNTs-COOH條件下,CAT酶活性均表現(xiàn)為復合組低于單一組,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1時,兩者差異顯著(P<0.05)。在各濃度MWCNTs-COOH條件下,APX酶活性均表現(xiàn)為復合組均高于單一組。在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時, POD酶活性表現(xiàn)為復合組顯著低于單一組(P<0.05);在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0～10.0 mg·L-1時,復合組顯著高于單一組(P<0.05)。

由圖4可以看出,各處理組4種抗氧化酶同工酶圖譜和帶型光密度(代表酶活性)變化不盡相同。SOD同工酶圖譜均顯現(xiàn)4行帶。CAT同工酶圖譜只出現(xiàn)1行帶。APX同工酶圖譜在復合組中均誘導了3行帶的出現(xiàn),而其他處理組只有2行帶。POD同工酶圖譜在5.0～10.0 mg·L-1單一組誘導了帶型數(shù)量的減少和帶型光密度的變化(與對照組相比);在2.5 mg·L-1復合組誘導了帶型數(shù)量和帶型光密度明顯減少,而5.0～10.0 mg·L-1復合組誘導了帶型光密度顯著增加(與Pb+Cd處理組相比)。比較各處理組的酶活性(圖3)與其同工酶帶型光密度(圖4),發(fā)現(xiàn)兩者變化趨勢基本一致。

CK為對照組; a為2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; b為5.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; c為10.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; d為20 μmol·L-1Pb+5μmol·L-1Cd; e為20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; f為20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; g為20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+10 mg·L-1 MWCNTs-COOH。

2.3 蛋白羰基化產(chǎn)物、HSP70和EP同工酶圖譜的變化

如圖5所示，與對照組相比,MWCNTs-COOH單一組蛋白羰基化產(chǎn)物的帶型光密度呈先降低再升高的趨勢。與Pb+Cd處理組相比,MWCNTs-COOH復合組蛋白羰基化產(chǎn)物的帶型光密度亦呈先降低再升高的趨勢。同一濃度MWCNTs-COOH條件下,MWCNTs-COOH復合組蛋白羰基化產(chǎn)物的帶型光密度始終高于MWCNTs-COOH單一組。

與對照組相比,MWCNTs-COOH單一組HSP70含量呈升高趨勢。與Pb+Cd處理組相比,MWCNTs-COOH復合組HSP70含量呈降低趨勢。MWCNTs-COOH復合組與MWCNTs-COOH單一組相比,在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5～5.0 mg·L-1時,HSP70含量表現(xiàn)為復合組明顯高于單一組;但MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1時, HSP70含量表現(xiàn)為復合組遠低于單一組。

EP同工酶圖譜可見3行白色帶,且?guī)蛿?shù)量未見增減,但其光密度發(fā)生明顯改變。各處理組EP同工酶帶型光密度均高于對照組,且總體呈上升趨勢,表明其酶活性被誘導而升高。

2.4 NPT產(chǎn)物含量的變化

如圖6所示，與對照組相比,MWCNTs-COOH單一組NPT含量呈先升高后降低再升高的趨勢,MWCNTs-COOH單一組NPT含量始終高于對照組。10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組誘導了NPT含量顯著升高(P<0.05)。與Pb+Cd單一組相比,MWCNTs-COOH復合組NPT含量呈先略微降低再升高趨勢,其中5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復合組NPT含量被顯著誘導(P<0.05)。與MWCNTs-COOH單一組相比,MWCNTs-COOH復合組NPT含量在各濃度MWCNTs-COOH條件下均高于單一組,且MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0～10.0 mg·L-1時兩者差異顯著(P<0.05)。

CK為對照組; a為2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; b為5.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; c為10.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; d為20 μmol·L-1Pb+5μmol·L-1Cd; e為20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; f為20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; g為20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+10 mg·L-1 MWCNTs-COOH。

CK為對照； 2.5、5.0、10.0分別表示2.5、5.0、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH； Pb+Cd表示20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd。直方柱上方小寫字母不同表示處理間某指標差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其復合暴露對O2·-和H2O2產(chǎn)物的影響

植物通過各種途徑產(chǎn)生O2·-和H2O2,它們性質(zhì)活潑,有很強的氧化能力,對許多生物功能分子都有破壞作用,稱為活性氧(ROS)。有研究表明,ROS的迅速積累及所導致的氧化損傷被認為是MWCNTs積聚而導致植物毒性的根本原因[4,6-7]。該研究中,無論是MWCNTs-COOH單一處理還是MWCNTs-COOH與Pb+Cd復合暴露,MWCNTs-COOH均顯著誘導了蠶豆幼苗葉片中O2·-和H2O2的大量產(chǎn)生和積累,且MWCNTs-COOH濃度越高,O2·-和H2O2的累積量越大,ROS的大量產(chǎn)生和積累必然會加劇葉片組織的氧化損傷和毒性效應。而且,過量的O2·-和H2O2可以通過Haber-Weiss或Fenton途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜姷腛H,導致細胞組分遭受更大的毒性效應。伴隨著上述活性氧自由基的積累,細胞中蛋白質(zhì)羰基化水平呈上升趨勢。

3.2 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其復合暴露對4種抗氧化酶活性及同工酶圖譜的影響

ROS也是信號分子,可以誘導植物體的氧化應激反應[25]。為了控制ROS的產(chǎn)生和積累,植物體通常通過上調(diào)一系列抗氧化酶同工酶的合成來緩解ROS積累可能導致的氧化損傷。如SOD酶可以將O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2;CAT和POD酶可以將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2;APX酶是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的重要組分,參與清除H2O2[16]。該研究中,MWCNTs-COOH單一、Pb+Cd及其復合暴露均誘導了上述4種抗氧化酶同工酶及其活性不同程度升高。這在一定程度上減少了ROS的積累,緩解了MWCNTs-COOH及Pb+Cd對蠶豆幼苗的氧化脅迫。部分抗氧化酶活性在高濃度MWCNTs-COOH條件下降低,這可能是由于過量的ROS累積超出了防御酶系統(tǒng)的清除能力,并抑制了酶活性,反映出各種抗氧化酶活性對ROS的清除能力及敏感性或耐受力的不同。值得注意的是,無論是MWCNTs-COOH單一處理,還是MWCNTs-COOH與Pb+Cd復合暴露,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時,與對照組相比,只有CAT酶活性被顯著誘導(P<0.05)。因此,CAT可作為診斷MWCNTs-COOH或MWCNTs-COOH復合重金屬環(huán)境污染的敏感的生物標志物。這與10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH 與Pb+Cd的復合導致CAT酶活性是唯一降低至對照組以下的處理這一結(jié)論也是一致的,即CAT酶活性的敏感性再次被證明。此外,MWCNTs-COOH復合組中SOD和CAT酶活性低于MWCNTs-COOH單一組,APX和POD酶活性高于MWCNTs-COOH單一組,這應與Pb+Cd的作用有關(guān)。

3.3 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其復合暴露對蛋白羰基化產(chǎn)物、HSP70和EP同工酶圖譜的影響

當ROS自由基的積累超出抗氧化酶的清除能力時,自由基通過直接氧化修飾蛋白質(zhì)分子的氨基酸側(cè)鏈,或者與脂質(zhì)過氧化,或糖基化的醛基產(chǎn)物發(fā)生次級作用,進而誘導多肽鏈中羰基化基團的產(chǎn)生和積累[22,26]。因此,可以利用羰基化衍生物含量的高低來判定植物組織細胞氧化損傷的程度。該研究中,無論是MWCNTs-COOH單一處理,還是MWCNTs-COOH與Pb+Cd復合暴露,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度增加至10.0 mg·L-1時,蛋白質(zhì)分子的羰基化水平顯著升高,表明此時葉片組織正遭受嚴重的氧化損傷,這與O2·-和H2O2在此時累積量最大的結(jié)果也是相符的。當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為5.0和10.0 mg·L-1,MWCNTs-COOH復合組蛋白羰基化產(chǎn)物的帶型光密度要高于Pb+Cd處理組,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1時尤為明顯,說明MWCNTs-COOH的添加加劇了葉片的氧化損傷。

有研究報道,異常蛋白的積累可誘導HSP基因的表達[27]。HSP70的生理功能涉及到變性蛋白質(zhì)分子的修復或降解、細胞自穩(wěn)態(tài)的維持及生物體對各種脅迫因子的適應,通常被作為監(jiān)測植物環(huán)境脅迫的生物標志物[28]。該研究中,羰基化蛋白的含量變化與葉片組織中HSP70產(chǎn)物的合成關(guān)系密切。MWCNTs-COOH單一組與對照相比,HSP70的合成呈增加趨勢,且顯著升高,表明由于MWCNTs-COOH加入及濃度的不斷升高,導致了蠶豆幼苗葉片細胞氧化脅迫損傷的加劇,進一步誘導了HSP70的合成并參與到氧化損傷蛋白的修復過程當中;隨著HSP70含量的增加,在一定MWCNTs-COOH濃度范圍內(nèi)羰基化蛋白呈現(xiàn)降低,但當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1時,雖然HSP含量最多,但羰基化蛋白反而增加,這說明自由基誘導的氧化損傷蛋白的積累超出了HSP70的清除能力。MWCNTs-COOH復合組與Pb+Cd處理組相比,HSP70的含量呈下降趨勢,表明MWCNTs-COOH加入抑制了HSP70的合成;當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為2.5和5.0 mg·L-1時,復合組HSP70及羰基化蛋白的含量明顯要高于對照組和MWCNTs-COOH單一組,表明其細胞氧化損傷程度與MWCNTs-COOH單一組相比更甚;同時,當MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1時,雖然羰基化蛋白的含量最高,但HSP70的含量卻出現(xiàn)極為明顯的降低,表明此時氧化脅迫已經(jīng)遠遠超出了HSP70蛋白的修復能力,HSP70蛋白本身可能已經(jīng)失活或損傷?？梢钥闯?MWCNTs-COOH復合組的毒性效應明顯更強。

實際上,復合污染按污染物之間的相互關(guān)系可分為非交互作用(劑量加加、效應加加作用)和交互作用(協(xié)同、拮抗作用)[29]。該研究中,MWCNTs-COOH復合Pb+Cd污染是屬于非交互作用還是交互作用中的協(xié)同作用，尚需結(jié)合其他實驗數(shù)據(jù)綜合判斷。如后續(xù)研究可以對MWCNTs-COOH復合組蠶豆幼苗葉片組織中的重金屬含量進行定量測定,如與Pb+Cd處理組大體相當,則可判斷是非交互作用,反之,則可斷定是協(xié)同作用。同時,HSP70蛋白的誘導表達和響應水平較敏感,可作為指示MWCNTs-COOH或MWCNTs-COOH復合重金屬環(huán)境污染誘導蠶豆幼苗葉片組織早期氧化脅迫的生物標志物。另外,ROS也被證明與HSP70的表達有關(guān)[30-31]。結(jié)合該研究,筆者認為,高濃度的MWCNTs-COOH通過ROS途徑誘導了蠶豆幼苗葉片組織內(nèi)氧化修飾蛋白的產(chǎn)生和積累,進而誘導了HSP70表達水平的升高。

細胞內(nèi)被氧化修飾的蛋白質(zhì)分子通?？杀话麅?nèi)蛋白降解酶(如EP等)選擇性降解,在植物組織中也存在這種現(xiàn)象[32]。EP有多個同工酶,用于降解衰老或氧化脅迫誘導的損傷蛋白[23,26]。該研究中,無論是MWCNTs-COOH單一處理,還是MWCNTs-COOH與Pb+Cd復合暴露,均誘導了EP同工酶活性的升高,MWCNTs-COOH濃度越高,酶活性升高越明顯,且MWCNTs-COOH與Pb+Cd復合后,EP酶活性提升尤為明顯,表明暴露于高濃度的MWCNTs-COOH的蠶豆幼苗葉片組織內(nèi)大量的氧化損傷蛋白正被EP促進降解。因此,羰基化蛋白的產(chǎn)生和積累可能是誘導EP同工酶活性升高的因子之一,EP同工酶活性的誘導是蠶豆幼苗解毒的機制之一。值得注意的是,不論是MWCNTs-COOH單一處理,還是MWCNTs-COOH與Pb+Cd復合暴露,在MWCNTs-COOH質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1時,雖然EP同工酶的活性升高,但蛋白羰基化產(chǎn)物的含量反而增加,這表明蠶豆葉片組織的氧化損傷已非常嚴重,EP同工酶活性雖趨于升高,但可能已超出其降解清除能力。

3.4 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其復合暴露對NPT產(chǎn)物的影響

巰基化合物在植物對重金屬耐受和解毒中起到重要作用,而其中關(guān)系最緊密的當屬谷胱甘肽(GSH)、植物絡合素(PC)和半胱氨酸(Cys)在內(nèi)的NPT物質(zhì)[24,33]。植物利用NPT中的重要組分,即GSH合成PC,與重金屬鰲和形成無毒的絡合物轉(zhuǎn)運到胞外或儲存在液泡等細胞器內(nèi),以降低重金屬離子的毒性[34]。該研究中,所有處理組葉片組織中NPT產(chǎn)物與對照相比均呈增加趨勢,且10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH單一組、5.0和10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH復合組與對照相比差異顯著,表明MWCNTs-COOH和Pb+Cd脅迫下蠶豆幼苗可通過合成大量NPT產(chǎn)物以緩解外源污染物的氧化損傷或毒害程度。同時,NPT產(chǎn)物中的GSH還是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑和信號物質(zhì)[35],GSH可以直接降低細胞內(nèi)H2O2含量[36]。因此,MWCNTs-COOH單一組中,各處理組的NPT均高于對照組,但溶液中并無重金屬,這應是由于MWCNTs-COOH誘導了H2O2的大量產(chǎn)生和積累,從而進一步誘導GSH的合成所致。MWCNTs-COOH復合Pb+Cd后,各處理組的NPT產(chǎn)物含量與Pb+Cd處理組相當或顯著高于Pb+Cd處理組,這可能是由于外源MWCNTs-COOH加劇了植物葉片中Pb+Cd的富集,而重金屬元素的富集進一步誘導了NPT合成及含量的顯著增加。

4 結(jié)論

(1) MWCNTs-COOH單一或MWCNTs-COOH復合Pb+Cd誘導了蠶豆幼苗葉片組織中O2·-和H2O2的大量產(chǎn)生和積累,且MWCNTs-COOH濃度越高,O2·-和H2O2的累積量越大。ROS的大量產(chǎn)生和積累加劇了蠶豆幼苗葉片組織的氧化損傷和毒性效應,導致氧化損傷蛋白(蛋白羰基化產(chǎn)物)的顯著增加。

(2) ROS作為信號分子誘導了SOD、CAT、APX及POD等同工酶及其酶活性的升高,增強了蠶豆幼苗葉片清除ROS的能力,一定程度上減緩了自由基的積累。HSP70的誘導表達和EP同工酶活性的升高表明細胞內(nèi)損傷蛋白的修復或促進降解活性的增加。同時,NPT產(chǎn)物的合成亦被顯著誘導,以降低重金屬離子的毒性和細胞內(nèi)H2O2的含量。

(3) 與Pb+Cd單一處理相比,MWCNTs-COOH與 Pb+Cd復合后抑制了HSP70的合成,促進了蛋白羰基化和NPT產(chǎn)物的累積,并顯著提升了EP酶活性,加劇了葉片的氧化損傷和蛋白降解。