梁曉艷，顧寅鈺，李 萌，宋延靜，張海洋，付 嬈，王向譽，郭洪恩

(山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002)

土地鹽漬化是影響生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的全球性問題。據(jù)統(tǒng)計，全球鹽漬化土地面積大約有9.55×108hm2，其中我國約有3.6×107hm2，占全國可利用土地面積的4.88%，且隨著人類耕作活動的增加，鹽漬化土壤面積呈逐年不可逆的形式增加[1]。預計到2050年，可用耕地的50%將面臨鹽漬化[2]。提高作物的耐鹽性，擴大作物的鹽堿地種植面積是解決我國土地資源短缺的重要途徑。

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物，花生種植面積和產(chǎn)量均居世界前列，但由于巨大的人口壓力及不斷增長的植物油消費量，我國食用植物油供給率嚴重不足，在避免油料作物與糧爭地的前提下，大力拓展花生在鹽堿地的種植面積，增加花生總產(chǎn)量是保證我國食用油供給安全的重要途徑之一。花生屬于中等耐鹽作物，花生對鹽脅迫的適應性與花生品種和生育期有關，研究表明不同花生品種耐鹽脅迫的能力不同，隨著鹽濃度的增加，其植株生長速率、植株含水量、葉片水勢、光合色素、總碳水化合物等性狀均明顯下降[3]；另外，花生不同生育時期的耐鹽能力不同，其中芽期和幼苗期對鹽害最敏感[4]。前人通過對花生出苗速度、植株形態(tài)和生物量等指標對不同基因型花生品種的萌發(fā)至幼苗期的耐鹽性進了鑒定，并采用聚類分析將其分為高度耐鹽型、耐鹽型、鹽敏感型和高度鹽敏感型4種類型[5-6]。

目前關于花生耐鹽性的研究已有不少報道，但多集中于種質資源的耐鹽篩選以及鹽脅迫下花生的基本生理響應等方面[6-8]，而關于不同耐鹽水平花生的耐鹽適應機制仍缺乏系統(tǒng)深入的研究，本研究擬從植株形態(tài)發(fā)育、光合特性、葉片及根系活性氧代謝及滲透調節(jié)物質等多方面研究不同耐鹽性花生品種之間的耐鹽適應性差異，探明不同耐鹽性花生品種的耐鹽適應機制，以期為花生耐鹽品種的選育及花生耐鹽性的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生品種為花育25(HY25)、花育22(HY22)和花育33(HY33)，其中HY25為高度耐鹽品種，HY22為耐鹽品種，HY33為鹽敏感品種[5-6,9]，3個品種均購自山東省花生研究所。

1.2 試驗設計

NaCl脅迫試驗采用室內水培法。首先，分別選取3個品種均勻、飽滿、大小一致的花生種子在1% 次氯酸鈉中浸泡15 min，進行消毒，用無菌水反復沖洗3 次后，放在恒溫培養(yǎng)箱中進行浸種催芽，出芽后分別播于裝有蛭石的營養(yǎng)缽中，用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液進行澆灌，生長2 d 后挑選生長一致的植株洗凈根部蛭石，保留子葉定植于裝有8L Hoagland 營養(yǎng)液的水培槽中，每個水培槽內定植12株花生，調節(jié)pH值6.3，全天進行充氣泵充氣，每2 d更換1次營養(yǎng)液，培養(yǎng)室內釆用高壓鈉燈補光，光照時間為14/10 h(晝/夜)，溫度設為 25℃/20℃，光強為 100μmol/(m2·s)，水培槽內營養(yǎng)液培養(yǎng)5 d 后分別進行不同濃度的NaCl處理，試驗共設4個NaCl濃度處理，分別為50、100、150、200 mmol·L-1NaCl，以不加NaCl的Hoagland 營養(yǎng)液作為對照，其他各處理分別在Hoagland營養(yǎng)液中加入不同量的NaCl以達到設定濃度，每處理設3次重復。各處理在設定NaCl濃度的營養(yǎng)液中統(tǒng)一培養(yǎng)15d后進行取樣，測定相關生長發(fā)育及生理生化指標，培養(yǎng)期間每2 d更換一次營養(yǎng)液。

1.3 測定項目和方法

根系及地上部生物量的測定，每處理取3株代表性植株用自來水沖洗后吸干水分，將根、莖、葉分開，放入烘箱內105℃殺青30 min，之后70℃烘干至恒重，稱取干重。取主莖上第二個展開葉及根系的毛細根進行相關生理生化指標的測定。葉片光合色素含量的測定經(jīng)95%乙醇浸提采用紫外分光光度法[10]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)還原法[11]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[10]；過氧化氫酶(CAT) 活性采用紫外分光光度法[12]；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[12]；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法G-250染色法[10]；游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮比色法[10]。

1.4 試驗數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2003、SPSS 10.0 軟件進行數(shù)據(jù)的整理和作圖，采用LSD法進行差異顯著性檢驗(α= 0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同耐鹽性花生品種植株生物量及根冠比的差異

由表1可知，不同花生品種地上部生物量隨著NaCl濃度的增加，均呈逐漸降低的趨勢，在不同濃度鹽脅迫處理下，HY25和HY22的地上部生物量均顯著高于HY33；根系生物量和總生物量在50 mmol/L NaCl濃度下最大，之后逐漸降低，在100～200 mmol/L NaCl濃度下，HY25和HY22的根系生物量和總生物量均顯著高于HY33。無NaCl脅迫下，三個花生品種的根冠比無顯著性差異，隨著NaCl濃度的增加根冠比呈先升高后降低的趨勢，在150 mmol/L NaCl濃度下達到最大值，不同NaCl濃度下根冠比均高于對照，由此可見，不同濃度NaCl脅迫對花生地上部的抑制作用大于對根系的抑制；在100、150、200 mmol/L NaCl濃度下，HY25的地上部生物量與對照相比下降幅度分別為27.6%、37.9%和43.1%，HY22的下降幅度為25.9%、44.8%和46.6%，HY33的下降幅度分別為35.2%、53.7%和59.3%。由此可見，NaCl脅迫對鹽敏感品種地上部的抑制作用大于高度耐鹽及耐鹽品種。

表1 不同耐鹽性花生品種生物量及根冠比的差異

注：同列內同一指標中不同小寫字母表示不同品種間差異顯著 (p<0.05)。下同。

Note: Different small letters in the same column and index indicates significant difference between different varieties (p<0.05) . The same below.

表2 不同耐鹽性花生品種葉片光合色素含量的差異 單位：mg/g

2.2 不同耐鹽性花生品種葉片光合色素含量的差異

表2可知，不同濃度NaCl脅迫處理對不同花生品種葉片的葉綠素含量、葉綠素a/b及類胡蘿卜素含量均有重要影響，不同品種之間葉綠素及類胡蘿卜素含量存在顯著差異，葉綠素a/b差異不顯著。無NaCl脅迫下，不同花生品種的葉片葉綠素a+b含量和類胡蘿卜素含量均表現(xiàn)為HY33>HY22>HY25，鹽敏感品種HY33顯著高于HY22和HY25，隨著NaCl濃度的增加，各品種均呈先升高后降低的趨勢，HY25和HY22均在100 mmol/L NaCl濃度下達到最大值，二者均顯著低于HY33，HY33在50 mmol/L NaCl濃度下達到峰值，之后隨著NaCl濃度增加均呈下降趨勢，高濃度條件下，下降幅度較大，但HY33的葉綠素a+b含量和類胡蘿卜素含量仍高于HY22和HY25，且與HY22差異顯著，這說明HY33在對照與不同濃度NaCl處理下均具有較高的葉綠素及類胡蘿卜素含量，但隨著NaCl濃度的增加，HY33的葉綠素及類胡蘿卜素含量下降迅速，尤其是在高濃度NaCl脅迫下，降低幅度較大，這說明鹽敏感品種的葉片光合色素對NaCl脅迫反應較為敏感，對NaCl脅迫的適應能力低，而高度耐鹽及耐鹽品種在高濃度NaCl脅迫下光合色素含量下降較為緩慢。

2.3 不同耐鹽性花生品種葉片及根系SOD活性的差異

SOD是生物防御活性氧毒害的關鍵酶之一，主要功能是清除超氧陰離子自由基(O2-·)，減輕其對植物細胞的傷害。由圖1可看出，不同品種花生葉片中SOD活性均隨著NaCl濃度的增加呈逐漸升高的趨勢，在無NaCl脅迫條件下，HY33的葉片SOD活性顯著高于HY25和HY22，隨著NaCl濃度增加，SOD活性不斷升高，HY25和HY22的上升幅度明顯高于HY33，而且，HY33在200 mmol/L NaCl濃度下活性開始下降，說明NaCl脅迫條件下，花生高度耐鹽及耐鹽品種葉片的SOD活性比鹽敏感品種反應更迅速，且對NaCl脅迫的承受能力更高。從根系的SOD變化值可以看出，不同NaCl濃度下耐鹽品種HY25的SOD活性顯著高于其他兩個品種，其差異大于葉片間的差異，這說明高度耐鹽品種HY25的根系SOD活性與其他品種相比具有明顯的優(yōu)勢，而HY33的根系SOD活性在高NaCl脅迫下顯著下降，說明鹽敏感品種根系SOD對NaCl脅迫的調節(jié)能力較差。

2.4 不同耐鹽性花生品種葉片及根系POD活性的差異

POD 作為自由基清除劑，能催化過氧化氫及某些酚類的分解，消除活性氧和超氧陰離子自由基對細胞的傷害，從而保護細胞，增強植物對NaCl脅迫的抵御能力。從圖2可看出，花生葉片的POD活性均隨著NaCl濃度的增加呈上升的趨勢，其中葉片的上升幅度較大，不同耐鹽性品種之間POD活性表現(xiàn)出顯著的差異，高度耐鹽品種HY25和耐鹽品種HY22之間差異不顯著，二者均顯著高于鹽敏感品種HY33，在高鹽濃度下差異尤為顯著。根系中POD活性變化幅度相對較小，HY25和HY22呈逐漸增加的趨勢，而HY33呈先升后降的趨勢，在50 mmol/L NaCl濃度下開始下降，且活性顯著低于高度耐鹽及耐鹽品種。

2.5 不同耐鹽性花生品種葉片及根系CAT活性的差異

CAT是植物組織中能有效清除植物組織中的過氧化氫對細胞的氧化作用的酶，保護細胞膜免受自由基傷害。從圖3可看出，不同NaCl濃度條件下不同耐鹽花生品種之間葉片CAT差異表現(xiàn)不同，無NaCl條件下，HY33的葉片CAT活性顯著高于HY25和HY22，50 mmol/L NaCl濃度下，HY25和HY22的CAT活性迅速增加，而HY33活性略有下降，隨著NaCl濃度增加，各品種CAT活性均呈上升趨勢，大于100 mmol/L NaCl脅迫條件下，HY33的CAT活性均高于HY25和HY22。根系中CAT活性隨NaCl濃度的變化趨勢與葉片不同，呈先升高后降低再升高的波浪形變化趨勢，不同NaCl濃度處理下，各品種的根系CAT活性均表現(xiàn)為：HY25>HY22>HY33，說明耐鹽品種與鹽敏感品種相比，其CAT活性的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在根系，葉片中CAT并沒有對耐鹽性的提高起主導作用。

圖1 不同耐鹽性花生品種葉片及根系SOD活性的差異Fig.1 Differences of SOD activity in leaves and roots of peanut varieties with different salt tolerance

圖2 不同耐鹽性花生品種葉片及根系POD活性的差異Fig.2 Differences of POD activity in leaves and roots of peanut varieties with different salt tolerance

2.6 不同耐鹽性花生品種葉片及根系MDA含量差異

MDA 是植物膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量高低可反映植株抗氧化能力和生理代謝的強弱。圖4可看出，花生葉片和根系中MDA含量均隨著NaCl濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，其中，葉片中MDA含量的上升幅度大于根系。在低NaCl濃度下(50 mmol/L NaCl)MDA含量變化幅度較小，隨著NaCl濃度的增加，MDA含量不斷積累，膜脂過氧化程度逐漸增加，其中，HY33的葉片和根系中MDA含量均顯著高于HY25和HY22，這說明鹽敏感品種的花生葉片和根系的膜脂過氧化程度顯著高于高度耐鹽品種和耐鹽品種，這可能與鹽敏感品種較低的抗氧化酶活性有關。

2.7 不同耐鹽性花生品種葉片及根系可溶性蛋白含量的差異

植株中可溶性蛋白含量在一定程度上反映了植物對逆境的抵抗和耐受能力。圖5可以看出，不同耐鹽性花生品種葉片和根系中可溶性蛋白含量隨NaCl濃度的變化趨勢存在差異，高度耐鹽品種HY25和耐鹽品種HY22的可溶性蛋白含量隨著NaCl濃度的增加呈逐漸升高的趨勢，而鹽敏感品種HY33表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，在0～100 mmol/L NaCl條件下HY33的葉片可溶性蛋白含量均顯著高于HY25和HY22，之后含量迅速下降，均低于其他兩個品種。根系中可溶性蛋白含量與葉片中變化趨勢相似，不同的是HY25在不同NaCl濃度下可溶性蛋白含量均高于其他兩個品種，而HY22在低NaCl濃度下含量較低，但隨著NaCl濃度的增加可溶性蛋白含量迅速增加，由此可見，在較高NaCl濃度下，高度耐鹽品種和耐鹽品種的可溶性蛋白含量的滲透調節(jié)能力要高于鹽敏感品種。

圖3 不同耐鹽性花生品種葉片及根系CAT活性的差異Fig.3 Differences of CAT activity in leaves and roots of peanut varieties with different salt tolerance

圖4 不同耐鹽性花生品種葉片及根系MDA含量的差異Fig.4 Differences of CAT activity in leaves and roots of peanut varieties with different salt tolerance

圖5 不同耐鹽性花生品種葉片及根系可溶性蛋白含量的差異Fig.5 Differences of the content of soluble protein in leaves and roots of peanut varieties with different salt tolerance

圖6 不同耐鹽性花生品種葉片及根系脯氨酸含量的差異Fig.6 Differences of the content of proline in leaves and roots of peanut varieties with different salt tolerance

2.8 不同耐鹽性花生品種葉片及根系脯氨酸含量的差異

脯氨酸是一種重要滲透調節(jié)物質，其含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。圖6可見，不同耐鹽性花生品種葉片及根系中脯氨酸含量均隨NaCl濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，不同品種之間也表現(xiàn)出明顯的差異，高度耐鹽品種HY25的葉片及根系脯氨酸含量均顯著高于耐鹽品種HY22和鹽敏感品種HY33，尤其在高NaCl濃度下差異更為顯著，耐鹽品種HY22的葉片及根系脯氨酸含量在低NaCl濃度下與鹽敏感品種差異相對較小，在高NaCl濃度下，顯著高于鹽敏感品種HY33。

3 討 論

3.1 鹽脅迫對不同耐鹽性花生品種形態(tài)發(fā)育的影響

不同作物耐鹽性不同，同一作物不同品種間耐鹽性亦存在基因型差異[13-14]，生物量的高低是反映植物綜合抗鹽能力的重要指標[15]，大量研究表明，鹽脅迫對植物的生長發(fā)育影響總體表現(xiàn)為抑制作用，首先表現(xiàn)為植株生長減緩，根系的伸長受抑制，鮮重的增長及干物質積累、側根的減少[5,16-17]。本研究結果與前人研究基本一致，地上部生物量均隨鹽濃度的增加呈逐漸降低的趨勢，不同的是在一定鹽濃度范圍內(50～100 mmol/L NaCl)，各品種根系生物量并沒有降低，反而有所增加，使根冠比在一定范圍內隨著鹽濃度的增加呈上升的趨勢。鹽脅迫下增加生物量在根部的分配是植物應對鹽脅迫的方式之一[18]，植物通過增加根系生物量來保證其對營養(yǎng)離子的吸收，而隨著鹽濃度的不斷增加，根系由于吸收過多的鹽離子，導致根系的生長發(fā)育受到抑制，造成生物量降低，這在其他植物的研究中得到過相似的結論[19]。本研究中，不同NaCl濃度下，鹽敏感品種的花生根冠比均高于高度耐鹽品種和耐鹽品種，原因可能是NaCl脅迫對鹽敏感品種地上部的抑制作用顯著大于高度耐鹽及耐鹽品種，導致根冠比過高，這也是高NaCl脅迫下鹽敏感品種耐鹽性差的重要表現(xiàn)性狀之一。

3.2 鹽脅迫對不同耐鹽性花生品種葉片光合色素含量的影響

葉片中光合色素含量是反映植物光合能力的一個重要指標，環(huán)境因子的改變會引起葉綠體色素含量的變化，進而引起光合性能的改變。然而，關于鹽脅迫下植物光合色素的變化規(guī)律仍存在一定爭議。大部分研究認為鹽脅迫會使葉片內光合色素發(fā)生降解，葉綠體結構解體，使光合作用受阻[10]，主要表現(xiàn)為葉綠素含量下降[21]，葉片的光能吸收和轉換效率降低[22]。然而也有研究者認為，鹽脅迫能引起植物葉片葉綠素含量增加[23-24]。

本研究結果表明，從0～200 mmol/L NaCl濃度下，不同耐鹽花生品種葉片葉綠素總量、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b均呈先升高后降低的趨勢，但是，在150 mmol/L NaCl濃度以內，不同花生品種葉片葉綠素含量及類胡蘿卜素含量均高于對照，這說明一定程度的鹽脅迫促進了光合色素的積累，原因可能是NaCl脅迫條件下植物葉片含水量過低、生長緩慢進而產(chǎn)生相對的“濃縮”效應；另一個原因可能是葉綠素的合成需要脯氨酸，而在NaCl脅迫下細胞中大量積累的脯氨酸在一定程度上促進了葉綠素的合成。隨著鹽濃度的進一步增加，葉綠素及類胡蘿卜素含量迅速下降，均低于對照水平，其中，鹽敏感品種的下降幅度大于高度耐鹽及耐鹽品種，這說明鹽敏感品種對鹽脅迫的反應較為敏感，而耐鹽品種的光合色素含量變化相對較為穩(wěn)定。因此，葉綠素含量的多少不能直接反映花生品種的耐鹽性高低。

3.3 鹽脅迫對不同耐鹽性花生品種活性氧代謝的影響

鹽脅迫能誘導植物體內活性氧積累，對脂質、蛋白質和核酸造成氧化傷害而嚴重破壞正常代謝[25]。為了避免活性氧過量產(chǎn)生及其產(chǎn)生的傷害作用，植物特別是耐鹽植物在長期的進化過程中形成一套完善的清除活性氧系統(tǒng)，具有維持活性氧代謝水平、保持膜結構和功能穩(wěn)定的作用?？寡趸赶到y(tǒng)是清除活性氧的重要保護酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)中酶活性的變化是鹽脅迫條件下的重要生理反應。本研究結果顯示，隨著NaCl濃度的增加，葉片和根系中SOD、POD及CAT活性的變化總體呈上升的趨勢，超過一定濃度后活性逐漸降低，其中葉片中酶活性的變化幅度大于根系，說明葉片中抗氧化酶活性對NaCl脅迫的反應更為靈敏。不同耐鹽性花生品種之間抗氧化酶活性存在顯著差異，在較高NaCl濃度下，高度耐鹽及耐鹽品種的葉片SOD和POD活性均顯著高于鹽敏感品種，而CAT活性沒有表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，這說明NaCl脅迫條件下兩個耐鹽品種在葉片活性氧清除過程中SOD和POD兩種酶發(fā)揮了主要作用，這與其他植物的研究結果有所差異[26-27]，這可能與不同植物的活性氧代謝差異有關。鹽脅迫下，鹽敏感品種中較低的抗氧化酶活性，導致活性氧代謝速度緩慢，丙二醛(MDA)含量不斷上升，加劇了膜脂的過氧化水平，這是鹽敏感品種耐鹽性差的重要生理反應之一。

3.4 鹽脅迫對不同耐鹽性花生品種滲透調節(jié)物質的影響

多數(shù)研究表明，鹽脅迫條件下，植物體內會大量積累脯氨酸、可溶性蛋白等有機物質[31-33]，且研究表明，鹽敏感的水稻品種葉片在鹽脅迫下會比耐鹽品種積累更多的可溶性糖[17]。本研究結果與前人研究結果存在一定差異，隨著NaCl濃度的增加，花生葉片和根系的可溶性蛋白和脯氨酸含量的變化趨勢因花生品種的耐鹽性不同而存在差異，耐鹽品種的葉片及根系可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈逐漸增加的趨勢，高度耐鹽品種高于耐鹽品種，葉片中二者的上升幅度大于根系，鹽敏感品種的葉片脯氨酸含量呈逐漸上升的趨勢，根系脯氨酸含量及可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的趨勢，較高NaCl濃度(>150 mmol/L NaCl)下，其脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均低于高度耐鹽及耐鹽品種，這說明NaCl脅迫下，高度耐鹽及耐鹽花生品種能夠合成更多的可溶性蛋白和脯氨酸，來提高其滲透調節(jié)能力，而關于耐鹽品種與鹽敏感品種之間其他有機及無機滲透調節(jié)物質的代謝及生理差異仍有待于進一步深入研究。