蔣雪薇 ，葉 菁，許延濤，寧靜恒，2，3，羅曉明，呂變梅，李赤翎，2*

(1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長沙 410114; 2.湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410600;3.湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410114)

1 引 言

近年來，食品安全已經(jīng)成為全民關(guān)注的熱點(diǎn)，其中微生物污染導(dǎo)致的食品質(zhì)量安全問題顯得尤為突出，因此建立安全快速的檢測方法十分迫切。目前常用的微生物快速檢測方法有PCR法、免疫法、生物傳感器法等［1-2］，其中以量子點(diǎn)為熒光探針的快速檢測技術(shù)具有特異性強(qiáng)、檢出限低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)［3-4］。量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)材料是決定熒光檢測技術(shù)靈敏度的重要因素，傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，而其具有的生物毒性限制了其在食品微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用［5］。相較于半導(dǎo)體量子點(diǎn)，碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots，CQDs)具有制備簡單、價(jià)格低廉，擁有良好的光學(xué)性能、穩(wěn)定性與抗光漂白性等優(yōu)點(diǎn)［6-7］，此外，低細(xì)胞毒性、高生物相容性也使其在食品質(zhì)量安全檢測中的應(yīng)用日益受到重視［8］。Qu等［9］將以檸檬酸和尿素為碳源合成的CQDs水溶液來培育豆芽，研究結(jié)果表明CQDs具有較低的毒性和較好的生物相容性。Liu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，CQDs對土壤中的微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能和多樣性影響較小，在生物檢測方面具有巨大的應(yīng)用潛力。雖然CQDs具有很多優(yōu)于半導(dǎo)體量子點(diǎn)的性能，但其產(chǎn)率普遍低于核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)。為解決這一問題，學(xué)者們進(jìn)行了CQDs元素?fù)诫s研究，結(jié)果表明元素?fù)诫s不僅可以有效地提高產(chǎn)率，同時(shí)還能改良CQD的光學(xué)性能［11-12］。氮(N)是一種優(yōu)良的化學(xué)摻雜元素，Niu等［13］僅以谷氨酸作為前體，采用水熱法合成氮摻雜碳點(diǎn)(N-CQDs)，合成的N-CQDs表現(xiàn)出優(yōu)異的光學(xué)特征及獨(dú)特的熒光特性，證明了它們在生物成像中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

量子點(diǎn)的制備主要有電化學(xué)法、化學(xué)氧化法、水熱法等［14］。隨著研究的不斷深入，CQDs的制備方法越來越簡單，原料也越來越廉價(jià)。微波消解法因其工藝簡單、合成時(shí)間短、設(shè)備要求低而深受國內(nèi)外科研工作者的青睞［15］，但該方法制備的CQDs粒徑分布不均勻，可控性較差，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化原材料與制備條件［16］。本研究以檸檬酸、谷氨酸為原料，采用簡便的微波法合成修飾一步得到N-CQDs，探索優(yōu)化制備條件以獲得光學(xué)性能好、生物親和性佳的熒光量子點(diǎn)，為其在食品微生物檢測的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材料與儀器

透析袋(分子量7 000)購于北京索萊寶科技有限公司;檸檬酸、L-谷氨酸、聚乙二醇(PEG，4 000)購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器有NJL07-3型實(shí)驗(yàn)專用微波反應(yīng)器(南京杰金微波設(shè)備有限公司)、CS-45型熒光分光光度計(jì)(美國PE公司)、Avatar-360型紅外光譜儀(美國尼高力儀器有限公司)、UV-1800型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、JEM-3010型透射電子顯微鏡(日本精工JEOL公司)、Starter3C型pH計(jì)(美國奧豪斯儀器有限公司)。

2.2 N-CQDs的微波法制備及優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響

將80 mg/mL檸檬酸、12 mg/mL谷氨酸、80 mg/mL PEG混合均勻，加熱攪拌溶解至澄清，置于800 W 微波反應(yīng)器中分別反應(yīng)2，2.5，3，3.5，4 min。待反應(yīng)完成后放于冷水中快速冷卻，再用蒸餾水洗脫，經(jīng)透析提純后在340 nm激發(fā)波長下測熒光發(fā)射光譜。

2.2.2 反應(yīng)功率對熒光強(qiáng)度的影響

在確定最佳反應(yīng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，參照上述方法制備N-CQDs，微波反應(yīng)功率分別為600，700，800，900，1 000 W。

2.2.3 原料濃度對熒光強(qiáng)度影響

確定最佳反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)功率后，在預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取L9(34)正交設(shè)計(jì)對反應(yīng)原料用量進(jìn)行優(yōu)化，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels in the orthogonal design

2.2.4 pH對熒光強(qiáng)度的影響

優(yōu)化上述因素后，取1 mL制備好的N-CQDs稀釋液于10 mL容量瓶中，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH 值為 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 左右，然后用蒸餾水定容，待測定完熒光強(qiáng)度后再測量其pH值。

2.3 N-CQDs光學(xué)性能研究

采用透射電子顯微鏡、紫外分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)以及紅外光譜儀進(jìn)行N-CQDs光學(xué)性能研究。

3 結(jié)果與討論

3.1 影響量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的因素分析

3.1.1 反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響

熒光特性是N-CQDs最突出的性質(zhì)，關(guān)于其發(fā)光機(jī)理的解釋主要有量子域效應(yīng)［17］、發(fā)射陷阱機(jī)理［18］，可見量子點(diǎn)的尺寸及表面基團(tuán)是影響熒光性質(zhì)的關(guān)鍵性因素。微波法制備N-CQDs時(shí)，粒徑大小與反應(yīng)時(shí)間長短有關(guān)，因此反應(yīng)時(shí)間是影響其熒光強(qiáng)度的主要因素之一。對5個(gè)不同的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行考察，在340 nm激發(fā)波下的熒光發(fā)射光譜如圖1所示。由圖1可知，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的延長先增大后減小，反應(yīng)時(shí)間為3.5 min時(shí)熒光強(qiáng)度最大。N-CQDs的制備是一系列反應(yīng)依次進(jìn)行的過程，原料通過水解、聚合、碳化以及包裹等反應(yīng)過程最后形成熒光粒子。因此，在一定范圍內(nèi)延長反應(yīng)時(shí)間，有利于反應(yīng)的有效進(jìn)行，增大粒徑，從而增大熒光強(qiáng)度。而反應(yīng)時(shí)間過長時(shí)，由于PEG的分散作用而產(chǎn)生了消耗，導(dǎo)致先合成的N-CQDs間容易發(fā)生聚合，產(chǎn)生相互自猝滅現(xiàn)象，從而出現(xiàn)熒光強(qiáng)度降低［19］。此外，從圖1中還可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，發(fā)射波長發(fā)生紅移，這是由于N-CQDs粒徑隨反應(yīng)時(shí)間在增大，符合量子化尺寸效應(yīng)。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Fluorescence spectra of N-CQDs nanoparticles at different reaction time

3.1.2 反應(yīng)功率對熒光強(qiáng)度的影響

反應(yīng)功率也是影響N-CQDs粒徑大小的重要因素，優(yōu)化微波功率能夠制備尺寸可控、分布均一的量子點(diǎn)。在6個(gè)不同功率下反應(yīng)3.5 min制備N-CQDs，其熒光發(fā)射波長結(jié)果如圖2所示。在600～800 W間，隨著反應(yīng)功率的增大，N-CQDs的熒光強(qiáng)度逐漸增大，同時(shí)熒光峰位置逐步紅移。其原因可能是增大反應(yīng)功率，能夠加快原料水解，促進(jìn)N-CQDs的形成。而反應(yīng)功率為800～1 000 W時(shí)，N-CQDs的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)功率成反比，發(fā)射波長從429 nm藍(lán)移至411 nm。究其原因是反應(yīng)功率過大時(shí)，原料碳化嚴(yán)重，不利于N-CQDs的生成，因此出現(xiàn)熒光強(qiáng)度降低且發(fā)射波長藍(lán)移現(xiàn)象。反應(yīng)功率800 W時(shí)，熒光強(qiáng)度最高，因此選定800 W為最佳反應(yīng)功率。

圖2 反應(yīng)功率對N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Fluorescence spectra of N-CQDs nanoparticles at different reaction power

3.1.3 反應(yīng)濃度對熒光強(qiáng)度的影響

PEG在微波制備CQDs體系中起分散作用，同時(shí)由于其含有大量的羥基等基團(tuán)，因此也具有表面鈍化作用［19］。N元素的摻雜能夠調(diào)節(jié)碳環(huán)結(jié)構(gòu)，加快分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移速率，進(jìn)而有效地改善CQDs的熒光性能［20］。優(yōu)化原料與分散劑的配比對制備熒光性能好的N-CQDs具有重要意義。在反應(yīng)時(shí)間為3.5 min、反應(yīng)功率為800 W的條件下，以檸檬酸、谷氨酸、PEG的添加量進(jìn)行正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。由極差分析可以看出，原料配比影響熒光強(qiáng)度的因素順序?yàn)?C(檸檬酸)﹥B(谷氨酸)﹥D(空白)﹥A(檸檬酸)。其中，出現(xiàn)D(空白)﹥A(檸檬酸)有可能是pH過低或者攪拌不均勻等因素造成的。從表2還可知，熒光強(qiáng)度與 PEG的添加量呈反比，其原因是PEG的增加阻礙了檸檬酸與谷氨酸之間的聚合，導(dǎo)致N-CQDs的生成率降低，所以熒光強(qiáng)度減弱。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的最佳原料配比為C1B3A1，即檸檬酸 80 mg/mL、谷氨酸 16 mg/mL、PEG80 mg/mL。在最優(yōu)化條件下合成N-CQDs，并將其與1號試驗(yàn)制備的N-CQDs進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3。從圖3中可以看出，最優(yōu)化試驗(yàn)組和1號試驗(yàn)組的熒光發(fā)射峰均在430 nm處，但最優(yōu)化試驗(yàn)組的最大熒光強(qiáng)度比1號試驗(yàn)組的提高36.3%。

表2 原料濃度優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experiment results of the reaction materials

圖3 最優(yōu)化條件和正交最佳實(shí)驗(yàn)制備的N-CQDs的熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescence spectra of N-CQDs nanoparticles produced by the optimum and the test group 1

3.1.4 pH 對熒光強(qiáng)度影響

研究表明CQDs對pH具有依賴性，即酸堿環(huán)境能夠改變CQDs表面基團(tuán)的存在方式以及碳點(diǎn)之間的團(tuán)聚水平，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，但不同條件制備的CQDs對于pH的響應(yīng)卻是不一樣的［21-22］?？疾?pH對 N-CQDs的影響，對制備的N-CQDs在 pH 值為 2.48，3.00，3.92，5.28，5.99，7.32，8.41，10.59，11.07，11.72 時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析處理后得到圖4。由圖4中熒光強(qiáng)度變化曲線可知，N-CQDs在很廣的pH范圍內(nèi)都具有熒光發(fā)光性質(zhì)，且其熒光強(qiáng)度隨pH值的增大而增大。這有可能是由于N-CQDs四周分布了羧基、羥基等親水基團(tuán)，當(dāng)溶液處于酸性條件下時(shí)，粒子之間形成氫鍵發(fā)生團(tuán)聚，從而影響了熒光的發(fā)射。隨著堿性的增強(qiáng)，團(tuán)聚程度越來越低，單個(gè)粒子也逐漸增多，因此熒光強(qiáng)度增大。此外，從發(fā)射峰位置的變化圖也可以看出，pH為酸性時(shí)，吸收峰位置較大，粒徑也較大;當(dāng)pH增大時(shí)，吸收峰發(fā)生藍(lán)移，這表明團(tuán)聚程度降低，粒子的直徑逐漸減小。pH對N-CQDs的影響說明了該方法制備的熒光量子點(diǎn)具有較好的pH敏感性，利用該特點(diǎn)可以開發(fā)應(yīng)用于pH敏感性微生物的檢測傳感器。

圖4 pH對N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 pH effect on fluorescence emission of N-CQDs

3.2 N-CQDs光學(xué)性能研究

3.2.1 透射電鏡掃描分析

評判CQDs優(yōu)異特性的一個(gè)重要指標(biāo)是尺寸是否均一，而透射電鏡分析可以直觀得出粒子的尺寸分布圖。圖5為最優(yōu)化條件下合成的NCQDs的電鏡照片。從圖中可以得知N-CQDs外貌呈圓球形，并且在電鏡下可看到晶格條紋，說明其具有晶體結(jié)構(gòu);粒子粒徑在2.3～4.2 nm之間，平均尺寸為3.5 nm，尺寸分布均勻，分散性良好，表明PEG作為分散劑能有效防止粒子團(tuán)聚，其中有少量N-CQDs團(tuán)聚，可能是pH過低，粒子之間形成氫鍵引起的。

圖5 N-CQDs的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of N-CQDs

3.2.2 紫外和熒光光譜分析

紫外可見光吸收光譜是一種常用的表征方法。從圖6中可以看出，N-CQDs在可見光吸收區(qū)和紫外吸收區(qū)都沒有吸收峰，當(dāng)入射波長小于300 nm時(shí)，吸收率急劇上升，在230～300 nm間形成陡峭吸收邊，具有強(qiáng)吸收率，這說明量子點(diǎn)的粒徑均勻。同時(shí)，在紫光燈照射下，N-CQDs發(fā)射出明亮藍(lán)色熒光，且熒光持久不變(圖6插圖)。

圖6 N-CQDs的紫外-可見光吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption of N-CQDs

CQDs具有光致發(fā)光特性，即熒光發(fā)射波長及強(qiáng)度隨著激發(fā)波長的變化而變化的性質(zhì)［23-24］。從熒光發(fā)射光譜中可看到最大熒光強(qiáng)度和發(fā)射峰位置以及發(fā)射波長范圍。圖7為最優(yōu)化方案制備的N-CQDs的熒光發(fā)射光譜圖。由圖7可知，當(dāng)激發(fā)波長從300 nm增加到380 nm時(shí)，熒光發(fā)射峰的位置和強(qiáng)度隨之發(fā)生變化。熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，340 nm為最大激發(fā)波長，同時(shí)發(fā)射峰的位置隨激發(fā)波長的增大而出現(xiàn)紅移，該現(xiàn)象在很多研究中都有發(fā)現(xiàn)［25］。CQDs的激發(fā)波長依賴性可能與其尺寸不一有關(guān)系，不同尺寸的CQDs，吸收光和發(fā)射光的波長都會(huì)不同［26］。

圖7 N-CQDs的熒光發(fā)射光譜Fig.7 Fluorescence spectra of N-CQDs

3.2.3 紅外光譜分析

采用紅外光譜對在微波優(yōu)化條件下制備的NCQDs進(jìn)行表面基團(tuán)分析，結(jié)果如圖8所示。3 500～3 300 cm－1區(qū)域是—NH2的伸縮振動(dòng)，并與其形成氫鍵而締合的—OH伸縮振動(dòng)(3 400～3 200 cm－1)重疊，說明碳點(diǎn)富含羥基和氨基。2 871 cm－1處的強(qiáng)吸收峰為—CH3的反對稱伸縮振動(dòng)，1 634 cm－1處為—CO的特征吸收頻率，證明碳點(diǎn)四周有羧基。1 400 cm－1為—CH2的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 108 cm－1為C—O—C鍵伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，是檸檬酸或者谷氨酸之間發(fā)生聚合的有力證據(jù)。由此看出，粒子四周布滿羥基、羧基和氨基，這些官能團(tuán)不僅能提高N-CQDs的水溶性和生物相容性，也有利于N-CQDs的表面修飾。

圖8 N-CQDs的紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectra of the N-CQDs

4 結(jié) 論

N原子與C原子大小相似，在制備CQDs時(shí)摻雜N元素有利于改善粒子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提高熒光性能。以檸檬酸為碳源、谷氨酸為氮源、PEG為分散劑，采用一種工藝簡單、成本低廉及綠色環(huán)保的微波法制備了N-CQDs?？疾旆磻?yīng)時(shí)間、反應(yīng)功率、原料濃度對其熒光特性的影響，確定了最佳制備條件:檸檬酸80 mg/mL、谷氨酸 16 mg/mL、PEG 80 mg/mL，微波反應(yīng)功率800 W，反應(yīng)3.5 min。此外，試驗(yàn)還表明pH值對N-CQDs熒光強(qiáng)度影響顯著，堿性環(huán)境能夠抑制粒子間形成氫鍵，降低團(tuán)聚水平，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)隨pH值增大而增大的趨勢。優(yōu)化制備的N-CQDs尺寸均勻，大小在3.5 nm左右，分散性良好，能發(fā)出明亮穩(wěn)定的藍(lán)色熒光。NCQDs還具有激發(fā)波長依賴性，其熒光發(fā)射光譜隨激發(fā)波長的改變而變化，340 nm為最大激發(fā)波長，發(fā)射峰位置在430 nm。同時(shí)紅外光譜分析圖顯示N-CQDs表面富有羥基、羧基等親水基團(tuán)，生物相容性好，在食品檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。