葉 萱 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

1 有益真菌和生物防治策略

歐盟委員會為了減少農藥使用風險和降低農藥的使用對人類健康和環(huán)境的影響，出臺了有關農藥持續(xù)使用的歐盟指令2009/128/EC。此指令重要特征之一就是每個成員國應該開發(fā)和采用國家行動計劃，建立定量目標、措施和時間表來降低農藥使用對人類健康和環(huán)境的風險和影響，鼓勵開發(fā)和引入綜合害物管理或替代性方法或技術，降低對農藥使用的依賴。農業(yè)工業(yè)也釋放出強烈的信號，許多公司以前注重開發(fā)、登記和商業(yè)化化學農藥，現(xiàn)在收購已在開發(fā)或有潛力開發(fā)有益微生物的新生物農藥的小公司。

1.1 有益真菌

有益真菌(包括絲狀真菌和酵母)是一大類“好”生物，能夠干擾植物病原菌的生長，對植物有積極的影響，具有潛在生物活性，可開發(fā)為生物農藥。數(shù)個真菌品種以寄生、競爭、抗菌或誘導產生抗性等機制與植物病原菌相互作用。寄生是一個真菌直接攻擊另一真菌，是一個非常復雜的過程，主要包括3部分：識別、攻擊和隨后的滲透，最后殺死寄主。2個或更多生物需要相同的資源時，而只有一個生物使用此資源，它們之間就會進行競爭。除了營養(yǎng)，它們也會為空間或侵染點發(fā)生競爭，眾所周知在病原菌和有益生物間的競爭是生物防治的重要問題?？咕侵干a和釋放對其他微生物有毒或殺死其他微生物的分子，能有效防治植物病原菌。真菌能產生多種多樣有毒物質，有助于其定殖和占有基質。最后有益真菌定殖于植物，刺激寄主產生防御反應，提高對植物病原菌的抗性。

全球有數(shù)個商業(yè)化微生物農藥，可用于生物作物保護項目和綜合害物管理策略，后者可合用劑量減少的化學農藥。對化學殺菌劑的耐受性是有益菌株實際應用的一大優(yōu)勢。耐受性生物和殺菌劑合并使用，殺菌劑能夠限制天然生活于基質中的真菌種群的競爭，使有益生物發(fā)揮最大效力。如果有益真菌和與其相兼容的殺菌劑作用于同一靶標，有益真菌和殺菌劑合用可能具有相加效應，進行種子處理時，早期化學殺菌劑有很好的保護性，苗期有益真菌有高的保護作用，是種子處理的制勝策略。

木霉菌是研究最多的有益真菌之一，是商業(yè)化生物農藥主要使用的活性成分之一。這些真菌對許多化學農藥有耐受性，適宜用于綜合害物管理。

木霉菌主要存在于土壤中，除了木霉菌，研究人員正在調查未開發(fā)的生態(tài)小生境來發(fā)現(xiàn)新的品種和屬，或確定對植物病原菌有防治作用的新穎菌株?！靶路f”有益真菌——印度梨形孢(Piriformospora indica)促進扦插不定根的形成，增加對干旱的耐性，誘導赤霉素的產生，赤霉素能調節(jié)植物根的防御性。

1.2 對產生真菌毒素的植物病原菌的防治

防治產生真菌毒素的植物病原菌真菌很重要，因為它們被認為是對食品安全威脅最大的真菌。真菌毒素是低分子量的有毒化合物，是真菌產生的次級代謝產物，天然存在于全球約25%的糧食和飼料作物中。已知全球至少有300～400種真菌毒素具有生物活性，最常見的有黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、煙曲霉毒素和赭曲霉毒素A。這些化合物主要由曲霉屬、青霉屬或鐮刀霉屬菌產生。作物收獲前在田間可能會發(fā)生真菌毒素的污染，這主要取決于環(huán)境條件，在收獲后，由于貯存不當也會發(fā)生污染。

已開發(fā)了許多用于獲前和獲后的化學、物理和生物方法來防治產生真菌毒素的病原菌，防治真菌毒素污染風險的發(fā)生，或對糧食和飼料中積累的真菌毒素進行去污染或解毒。

本文主要介紹了在獲前谷物田和果樹園應用有益真菌，阻止獲后的真菌毒素的污染。表2列出了文中介紹的一些生物和其有益作用。

2 阻止谷物中真菌毒素的產生

主糧為全球人口飲食的主要組成部分，滿足一大部分熱量和營養(yǎng)需要。在全球5萬多植物品種中，15個作物提供的能量為全球人口攝入的90%，其中3種：水稻、玉米和小麥提供的熱量為這90%的2/3。這些谷物為40多億人口的主糧。在西歐，谷物占主糧的26%(根據能量估算)，在非洲，谷物為46%。

谷物為產生真菌毒素真菌侵染的常見靶標，這些真菌可引起田間數(shù)種作物產量損失，產生的真菌毒素在收獲的作物中積累導致其品質下降。然而在收獲后，在穎果和不正確貯存條件下真菌生長，繼續(xù)產生真菌毒素。筆者介紹了在栽培期間如何應用有益真菌以減少糧食和飼料商品中的真菌毒素積累的例子，主要為小麥上的赤霉菌造成單端孢霉烯污染，曲霉菌侵染玉米，產生黃曲霉毒素污染玉米。

表1 以木霉屬菌為生物活性成分的商業(yè)生物農藥

2.1 小麥上的赤霉菌

小麥為全球人口提供了所需的 20%卡路里，也是動物飼料的重要來源。全球人口的增長，對小麥的需求也在增加，小麥的生產對食品安全和全球經濟有重要影響。世界銀行估計全球小麥生產在2000～2050年將需要增加60%。全球農民將需要利用有限的資源，如肥料、農藥和水來增加小麥的生產。

赤霉病是全球小麥和其他小谷物的再發(fā)性病害，由數(shù)種真菌品種引起，禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和黃色鐮孢菌(Fusarium culmorum)是主要的致病菌。鐮刀菌屬菌侵染小麥穗后，常常產生單端孢霉烯，特別是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和其乙?；苌?-和15-乙?；撗跹└牭毒┐?，使小麥產量和品質都發(fā)生改變。

早期檢測和防治產生單端孢霉烯的鐮刀菌屬菌對阻止毒素進入食物鏈重要。有多種策略可降低赤霉病的影響，包括使用健康種子、作物輪作、耕作措施、耐受性栽培品種和應用殺菌劑。然而，其中單獨一種策略無法降低病害的影響，包括貯存期間產毒真菌的進一步發(fā)展。常用葉面殺菌劑防治真菌病害，如赤霉病，但非靶標真菌也可能受到影響。殺菌劑對非靶標生物的影響，如葉面真菌，可能壓制植物病原菌的競爭者腐生營養(yǎng)菌。

在病害發(fā)展周期中，農作物殘留物和開花期穗狀花序為重要問題。病原菌利用栽培殘留物進行越冬，而開花期是小麥對病原菌最敏感的生長階段。生物防治赤霉病需要用有益真菌處理作物殘留物以減少植物殘留物中的病原菌生物量，或處理開花期的穗狀花序，阻止病原菌侵染植物。兩種情況下，競爭營養(yǎng)和空間對有益菌株防治赤霉病菌重要。除了好的定殖競爭能力外，即先于病原菌定殖于土壤中的麥稈或取代栽培殘留物中的鐮刀菌屬菌，或定殖于穗狀花序，避免病原菌入侵花，重寄生和/或抗菌機制可能也有助于防治病原菌。有益真菌直接攻擊病原菌菌絲體以及抑制其生長可能減少接種體的存在量。

表2 獲前應用有益絲狀真菌和酵母防治獲后病原菌和阻止真菌毒素的積累

雖然應用有益真菌是潛在的防治赤霉病的好策略，但相關信息幾乎沒有。在實驗室和田間試驗中已研究了Trichoderma gamsii T6085，發(fā)現(xiàn)其作為拮抗劑，是天然基質的重寄生菌和競爭者，能降低禾谷鐮刀菌和黃色鐮孢菌的生長。T. gamsii處理水稻后21 d，病原菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的能力也顯著下降(禾谷鐮刀菌和黃色鐮孢菌分別從 151.04和22.05下降到4.99和1.75 mg/kg)，因此，潛在地降低了貯存期間此真菌毒素積累的風險。此菌株在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇存在時也能夠生長，這對于木霉菌屬是罕見的特征。此外，在田間把 Trichoderma gamsii T6085用于穗狀花序，能顯著降低病害的嚴重性(10%)。

粉紅粘帚霉(Clonostachys rosea)是另一被廣泛研究的防治赤霉病的生物防治劑的重要和有發(fā)展前景的有益真菌。粉紅粘帚霉菌株IK726是能夠防治產真菌毒素的鐮刀菌屬(包括禾谷鐮刀菌和黃色鐮孢菌)的重寄生菌株，能限制玉米烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的積累和降解玉米赤霉烯酮。在實驗室分析了粉紅粘帚霉降低小麥麥稈中禾谷鐮刀菌和黃色鐮孢菌孢子形成的能力，發(fā)現(xiàn)一些菌株有效。把其中1個菌株用于田間試驗，發(fā)現(xiàn)對禾谷鐮刀菌有生物控制活性，可導致病原菌的DNA減少68.3%。

在田間條件下粉紅粘帚霉ACM941菌株能夠降低不同作物殘留物上玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)子囊殼的產生(玉米、大豆和小麥殘留物中分別為93.1%、94.4%和84.0%)，降低小麥赤霉病的發(fā)病程度。因此，此菌株是有發(fā)展前景的生物防治劑，可有效用于赤霉病綜合管理項目。

粉紅粘帚霉菌株也對植物生產中使用的許多農藥不敏感或敏感性低，與減量的化學農藥合用能夠有效防治小麥鐮刀菌根腐病。已廣泛研究了粉紅粘帚霉對殺菌劑耐受性的機制，正在計劃田間合用此菌株與殺菌劑防治赤霉病。

除 Trichoderma gamsii和粉紅粘帚霉等絲狀真菌外，酵母菌也是有發(fā)展前景的生物防治劑，在收獲前使用防治赤霉病以及防止獲后真菌毒素的積累。Wachowska和Glowacka研究了溫室中生物防治劑出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)對冬小麥上赤霉病發(fā)展和鐮刀菌對谷粒污染的影響。出芽短梗霉菌使赤霉病發(fā)生程度減輕約20%，谷粒飽滿度增加5.0%，谷粒增加。

生物防治劑混用有時比單劑能更大程度降低植物病害，如1個淺黃隱球酵母(Cryptococcus flavescens)菌株和2個金黃色隱球酵母(Cryptococcus aureus)，它們是2個和3個菌株一起培養(yǎng)來評估不同混用對赤霉菌的作用。在溫室，一起培養(yǎng)淺黃隱球酵母和一個金黃色因秋菊奧姆菌株能顯著降低病害的發(fā)生程度(32.0%)。另一方面，在小麥田間試驗中，這兩個菌株一起培養(yǎng)病原菌生物量下降了。此方法看來很有前景，可深入研究。最后，在溫室中，把早熟禾鐮刀菌與鏈格孢屬、附球菌屬和木霉屬一起接種于小麥上，可降低赤霉病發(fā)病程度，但沒有減少 T-2毒素的積累。

2.2 玉米上的鏈格孢屬菌

全球玉米產量約為7.9億t，在一些國家，玉米提供的熱量和蛋白質為人們攝入的 1/3以上。黃曲霉毒素的存在，鏈格孢菌產生的致癌真菌毒素是影響此作物的廣泛風險。在田間，玉米花頻繁受到黃曲霉(A. flavus)、寄生曲霉(A. parasiticus)和集峰曲霉(Aspergillus nomius)等鏈格孢菌侵染，特別是在發(fā)展中國家，在收獲后的貯存期間，這些病菌進一步發(fā)展，作物被黃曲霉毒素污染。

100多個國家已加強或提議管理糧食和飼料中黃曲霉毒素水平。為了預防區(qū)域和國際市場對產品的拒絕，持續(xù)管理產黃曲霉毒素曲霉屬菌有助于阻止黃曲霉毒素相關的健康風險發(fā)生。作物抗性育種和轉基因工程，農藝技術措施的調整和生物防治是控制和管理黃曲霉毒素污染的主要策略。生物防治被認為是管理玉米污染的最有發(fā)展前景和有效的生態(tài)友好型方法。

在貯存期間，許多種害蟲危害谷物。昆蟲活動所產生的濕度是產真菌毒素真菌生存的理想條件，貯存玉米中昆蟲的數(shù)量應保持最少。已研究了昆蟲病原真菌淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)單用和與抗氧化劑 BHT[2,6-二(叔丁基)-對甲苯酚]合用防治傳播產黃曲霉毒素真菌的昆蟲介質雜擬谷盜(Tribolium confusum)的效果，發(fā)現(xiàn)二者合用能最有效地降低昆蟲介質的量和黃曲霉毒素 AFB的水平(真菌毒素減少99.3%，aw為0.97)。因此，這是綜合管理貯存玉米害蟲有發(fā)展前景的策略，也能降解真菌毒素污染的風險。

生物防治劑的使用要求要很好地掌握病原菌生命周期知識，已發(fā)現(xiàn)競爭是成功管理黃曲霉素對玉米污染的作用機制。鏈格孢菌屬黃曲霉有產黃曲霉毒素和不產生毒素的菌株。阻止黃曲霉毒素污染獲前敏感作物的生物防治策略為引入不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株與產黃曲霉毒素的曲霉菌競爭。此策略在防止玉米等數(shù)種作物不被黃曲霉毒素污染方面很有發(fā)展前景。

在全球的不同地方已數(shù)次成功應用單一不產毒菌株。2個菌株是2個制劑——AF-36 (Arizona 棉花研究和保護委員會，美國)和Afla-Guar (先正達作物保護公司，美國)的活性成分。這些生物產品已在美國商業(yè)化用于玉米，然而，許多其他不產毒素的菌株也在評估中。實際上，在意大利也在對相似的產品進行評估中，以持續(xù)降低黃曲霉毒素污染玉米的風險。

黃曲霉毒素極大阻礙了非洲人民健康和幸福水平的提高，他們長期暴露于不安全水平的黃曲霉毒素中。農民家庭在生產、貯存、制備和市場化消費的食物過程中，沒有真菌毒素污染風險意識。例如，在2015年在肯尼亞，至少230萬袋玉米含有較高水平的真菌毒素，不適宜消費和貿易，給成千上萬小農戶帶來巨大的經濟損失。同年，Okun和其合作者調查了肯尼亞種植玉米的土壤中真菌的種群，確定產黃曲霉毒素鏈格孢菌的分布和地方性不產毒素的菌株。在7個農業(yè)生態(tài)區(qū)收集到屬于黃曲霉和寄生曲霉的220菌株。用形態(tài)和生理學對它們進行了表征，以評估它們防治肯尼亞最重要的產毒素菌株的應用潛力。

北非熱帶國際農業(yè)研究所、美國農業(yè)部農業(yè)研究服務中心、波恩大學和伊巴丹大學間合作開發(fā)了Aflasafe產品，其是尼日利亞的4個不產毒素黃曲霉菌株的混合物。這些菌株能夠與產毒菌株競爭定殖于土壤中的有機物質和植物殘留物上。它們不會影響環(huán)境中的鏈格孢菌的總量，但促進這些真菌從產毒種群轉換為非產毒種群。

多個菌株的使用被認為是對生態(tài)友好的方法。報道多個不產毒素的黃曲霉菌株具有好的協(xié)同作用，能夠較大地降低田間黃曲霉毒素的污染。在2014年，Atehnkeng等人評估了以不同VCGs類別的4個不產毒黃曲霉菌株為活性成分的產品的活性，結果為其能67%～95.0%降低玉米被黃曲霉毒素污染的程度。

從生態(tài)的角度看，用不產毒素的黃曲霉有效防治產毒素的黃曲霉需要不產毒素黃曲霉菌能很好適應和生存于靶標農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中。在2014年，Ehrlich發(fā)表了一篇關于用不產生毒素的曲霉屬防治黃曲霉毒素污染綜述。Ehrlich介紹到這是當前降低獲前玉米被黃曲霉毒素污染最有發(fā)展前景的生物防治策略之一，但也分析了存在的諸多問題：⑴ 此方法的長期效力和引入的菌株在環(huán)境中的歸屬；⑵ 黃曲霉種群生物學特性未知；⑶ 氣候的改變對植物、病原菌和引入的不產生黃曲霉毒素的菌株的影響。

不產生黃曲霉毒素菌株干擾產毒素菌株的黃曲霉毒素累計的機制還不完全清楚。不產毒素菌株的有益影響被解釋為競爭排斥機制，即妨礙產生毒素菌株的生長或到達種子。最近 Damann的一篇綜述提出了此類生物防治活性的主要機制——“接觸抑制”作用。接觸抑制被定義為種內黃曲霉毒素抑制，是指在侵染過程中競爭菌株生長，菌絲物理相互作用或接觸，觸發(fā)阻礙黃曲霉毒素產生的反應。

Persons等人研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能有效抑制黃曲霉和寄生曲霉的生長，可以菌落形成單位(CFU)表示，在22 ℃作用最大。此研究開啟了用此酵母保護用于人類和動物食物的農產品免受這些病原菌釋放毒素代謝物的污染。

3 防止真菌毒素污染水果

3.1 葡萄上的曲霉屬菌

根據國際葡萄和葡萄酒組織，在2014年全球葡萄產量為7 510萬t，中國為第一大生產過國，生產1150萬t，隨后為意大利和美國，都約為700萬t。中國躋身為葡萄生產大國時間不久。在2015年，中國只排位第五，前4國為意大利、美國、法國和西班牙。一些葡萄用于釀酒，但全球許多的葡萄被制成果汁或葡萄干。

葡萄栽培中重要的安全環(huán)節(jié)為赭曲霉素A，它對腎有害，可致腎癌、致畸，抑制免疫反應。此真菌毒素在全球被認為是葡萄、葡萄酒、果酒以及葡萄果汁等其他葡萄產品的主要污染物。黑曲霉屬在葡萄園非常常見，而Aspergilli niger和Aspergilli carbonarius是最主要的病菌。它們被認為是葡萄中赭曲霉素 A和收獲后其衍生物的主要產生者，而 Aspergilli carbonarius被認為是赭曲霉素A的最主要產生者。

數(shù)個收獲前策略致力于降低真菌侵染的風險和中間和最終產品的毒素污染。盡管采用預防性策略，如保護葡萄不受機械和昆蟲損害以阻止產生赭曲霉素菌株定殖于受損的植物部分，或進行化學防治，但使用生物制劑是確保減少化學物質對環(huán)境和人類健康影響的最生態(tài)友好的方法。酵母被認為是用于防止赭曲霉素A污染葡萄風險的生物防治策略的最適宜生物。它們對營養(yǎng)需求簡單，能在不同環(huán)境條件下生存，生長速度快，不產生有毒化合物，特別適宜作為有益生物。酵母能夠定殖于水果表面，與植物病原菌競爭營養(yǎng)的能力強。另外，病原菌獲得的營養(yǎng)物質少，其次級代謝物質如真菌毒素產生減少。

附生酵母是葡萄果實表面微生物群落的最大部分，它們已適應了此生態(tài)生境，在獲前應用，能成功防治產生毒素的曲霉屬菌。季蒙假絲酵母(Candida guilliermondii)vs曲霉屬，東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis) vs Aspergilli carbonarius和Aspergilli niger，美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)和Candida incommunis vs Aspergilli carbonarius和Aspergilli niger，出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans) vs Aspergilli carbonarius，或Candida magnus和清酒假絲酵母(Candida sake) vs塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)為減少病原菌定殖于葡萄和葡萄腐爛的一些例子。

出芽短梗霉菌除了能降低約30%曲霉菌屬侵染，也分別在2005和2006年以99%和90%減少葡萄汁中赭曲霉素的污染。耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)在田間能100%控制A. carbonarius和A. niger的生長，能降低約80%的毒素的積累。

環(huán)境對生物防治劑的活性和歸宿有大的影響，對葡萄/有益酵母/病原曲霉屬系統(tǒng)也是如此。De Curtis等人證實溫度和濕度對 2個出芽短梗霉菌菌株和1個美極梅奇酵母菌株對A. carbonarius的防治活性和黃曲霉素積累有影響，也分析了這些有益真菌在受損葡萄果實上的種群動態(tài)。發(fā)現(xiàn)溫度比相對濕度對有益真菌的保護作用影響更大，適宜于病原菌的環(huán)境條件最不利于有益真菌的活性。

一些研究者報道使用不產生赭曲霉素的曲霉菌防治葡萄的 Aspergilli carbonarius。Aspergilli carbonarius的不產生毒素的菌株非常罕見，有時一些不產生赭曲霉素的菌株實際屬于不同的黑曲霉品種。這些很少被分離的菌株可作為生物技術制劑用于食品工業(yè)和生物制劑防治葡萄園中赭曲霉素的產生。

在2015年，Ahmed等人首次報道了類阿達青霉(Penicillium adametzioides)能夠限制病原菌的生長和赭曲霉素的產生，可作為潛在的防治產生赭曲霉素的Aspergilli carbonarius的生物制劑。需要進一步研究此菌株，詳細了解降低赭曲霉素產生的機制，以及在天然環(huán)境中的行為和歸宿。

3.2 蘋果上的青霉菌

棒曲霉素是在蘋果上、蘋果汁和其他蘋果產品中發(fā)現(xiàn)的重要真菌毒素，影響人類和動物的健康。其具有致畸、細胞毒性，對生殖有毒作用，主要由擴展青霉(Penicillium expansum)產生。

棒曲霉素污染特別受關注，主要因為對此毒素污染敏感的許多加工食品為嬰兒食物。引起貯存腐爛的病原菌常常來自于田間或果園。產生毒素菌株的孢子出現(xiàn)于果樹上的水果中，但一般在水果收獲前它們不生長(或產生毒素)。良好的農業(yè)措施以及收獲前的保護方法對阻止病原菌侵染植物和被侵染的水果進入食物鏈很重要。有關果樹生長條件的數(shù)個因素可能影響真菌的侵染和蘋果中毒素的產生，這些因素包括在生長季進行葉面肥鈣噴霧或使用能降低獲前病原菌侵染蘋果的最少量氮。

圖1 從環(huán)境(單個生物或群落水平)到綜合植物/微生物系統(tǒng)的成功生物防治策略的假設理想途徑流程圖

可應用殺菌劑、生物防治劑、利用誘導抗性、好的收獲措施、照射、熱水和降溫等獲前和獲后措施限制擴展青霉的侵染，很好地避免棒曲霉素污染蘋果。殺菌劑是用于防治獲前和獲后擴展青霉引起的根腐病最常見的方法。然而，考慮到當前立法和民意，正在研究新的生物替代方法，如使用從植物和水果分離的對病原菌有拮抗作用的附生微生物。因此，在獲前應用拮抗酵母是保護水果免受獲后病原菌危害和毒素積累的最有發(fā)展前景的措施之一。

把從水果和葉表面分離的出芽短梗霉菌和黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)以及有益細菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株用于田間蘋果樹，能顯著降低擴展青霉、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和蘋果炭疽病菌(Pezicula malicorticis)引起的病害傷口的大小和數(shù)量以及獲后蘋果腐爛病的發(fā)生。此外，當水果從田間轉入低溫貯存后，拮抗菌種群比對照處理要大。已評估了從健康蘋果表面分離的Candida membranfaciens和膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)防治擴展青霉生長引起的蘋果藍莓病的效果。在聯(lián)合培養(yǎng)中，拮抗菌對病原菌的生長抑制率 20%～60%，在揮發(fā)性代謝物試驗中抑制率50%～90%，在無細胞代謝試驗中抑制率55%～86%。另外，在室溫(20 ℃)和貯存溫度(5 ℃)，所有酵母能夠減少被接種蘋果上95%病斑面積。

已對來自比利時的異常畢赤酵母(Pichia anomala)菌株K研究了20多年。果園試驗表明其能很好防治擴展青霉，氣象條件的變化對種群密度和其效果有大的影響。有關環(huán)境條件對異常畢赤酵母作用的影響信息非常重要，因為可根據此決定在病原菌侵染前獲前處理是否足以很快定殖于傷口，或獲后再次處理以增加酵母種群密度是否是正確的做法。然而，需要進行更多的工作來評估獲前生物防治劑對擴展青霉的效果，確定是否生物防治影響獲后棒曲霉素的形成。

4 “組學”時代的生物防治

二代測序(Next Generation Sequencing, NGS)技術是植物防御和食品安全中有效的，仍在開發(fā)/應用的工具。生態(tài)基因組學可用于更好地了解有益真菌單菌株或群落水平的生態(tài)特征。此新研究領域可用于發(fā)現(xiàn)防治病害中真菌-植物和有益真菌-病原菌相互作用的主要分子機制、真菌適應環(huán)境的進化，發(fā)育和生態(tài)重要性狀。

二代測序也有助于在分類和功能水平上研究真菌種群，更好地把生物防治劑融入天然微生物組，設計真菌混用等用途。擴增子測序技術、宏基因組測序和宏轉錄組學是實現(xiàn)此目標的最常見的3種方法。擴增子測序是基于靶標特定基因組區(qū)段(通常為ITS——真菌的內轉錄間隔區(qū))的擴增和測序。宏基因組測序是基于全基因組鳥槍測序，導致短測序片段測序(short sequencing)進一步集結于重疊群(contig)。2種技術都能用來描述整個微生物群落，包括不可培養(yǎng)微生物和真菌。而宏轉錄組學也基于鳥槍測序，用于研究整個群落的基因轉錄。

用二代測序技術，主要擴增子方法進行數(shù)個研究，其結果能較完整地描述植物微生物群落的特征和這些群落對植物生長、植物健康和食品安全的影響。例如，用真菌內轉錄間隔區(qū)1 (ITS1)的高通量焦磷酸測序評估了不同種類樹的葉際真菌群落組成，并由此列成表。也用相同的方法檢測了這些可潛在被開發(fā)為生物防治劑的真菌種類。

由于全測序真菌基因組數(shù)量快速增加，包括眾所周知的或有潛力開發(fā)為生物防治劑的菌株，基因工程技術的進步對了解這些真菌的生物學、完全開發(fā)和賦予新的特性或性狀非常重要?；蚪M編輯是1種基因工程，可用于插入、取代DNA，或用人工工程核酸酶或“分子剪刀”從基因組去除 DNA。CRISPR-Cas9技術正成為觸發(fā)或抑制特定基因的大眾化工具，也已被成功用于粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)和Trichoderma reseei等絲狀真菌。此方法可用于生物防治產生毒素的真菌等植物病原菌。

用基因工具操縱真菌的重要生物學功能，如毒素的產生或分子對植物病原菌的活性，而在被編輯基因組中沒有留下外源DNA的痕跡，這為生產更好的生物防治劑打開了一扇新大門。這些包括不產毒或侵略性高的真菌寄生或競爭菌株，可作為增加食物安全的新工具。

5 結論和展望

聯(lián)合國糧農組織估計到2050年世界人口將達到91億，比現(xiàn)在增加34%，人口增長主要發(fā)生于發(fā)展中國家。為了保證食品安全，需要糧食生產增加70%。例如，每年的谷物生產需為今天的1.5倍(從21億t增加到約30億t)，每年肉類生產要翻倍。除了對糧食的需要增加外，糧食安全是另一巨大挑戰(zhàn)。聯(lián)合國糧農組織列出了保證全球糧食安全的3個必要條件：⑴ 促進技術改變和生產力增加；⑵ 支持貿易、市場和農民走向公平、競爭的全球系統(tǒng)，建立穩(wěn)定的糧食市場；⑶ 投資持續(xù)的農業(yè)生產和農村發(fā)展。

投資持續(xù)發(fā)展的農業(yè)能夠滿足不斷增長人口需求，逐漸生產出安全、高品質和不用農藥的糧食和飼料。減少化學農藥的使用有利于開發(fā)替代性害物管理策略，后者既可保護作物，也可保護施藥工人健康。而微生物農藥還可降低環(huán)境污染(土壤和水)或病原菌對殺菌劑抗性的產生等許多化學農藥的負面影響。

獲后病害會損害產品，造成巨大損失。特別是在發(fā)展中國家，沒有適宜的貯存和運輸條件，在收獲和搬運期，不正確的處理方法可能會損害作物。雖然“獲后”一詞暗示病害出現(xiàn)于獲后階段，但這種病害的管理需要從獲前田間開始。這是為了使收獲中的病原菌接種體的量最少，以降低獲后與其生長有關的風險，最終減少食品污染。

本文列舉的所有案例都是有關田間獲前使用有益真菌來阻止和管理貯存期毒素的積累。當然，并不是所有這些方案都能確定無疑地解決這個問題，但毫無疑問，這是發(fā)展趨勢，科研人員已開始進行大量研究。眾所周知，開發(fā)獲前生物防治劑能確保應用有益生物防治植物病原菌時能較早定殖于植物或植物部分的競爭優(yōu)勢，也能成功防治獲后作物產品不受產毒植物病原菌的危害，包括貯存霉菌。

能設想到此策略的進化嗎？當然，有多種可能情況存在。管理植物病害的生物方法進化的假設的理想途徑(也應用于管理獲前產毒素的真菌)以圖 4表示。從單個菌株到多種真菌合用來看，環(huán)境是決定其活性的主要因素。應用含有1個生物防治劑以上的制劑是多營養(yǎng)方法。這些生物防治劑對單個或多個植物病原菌有相加或協(xié)同效果，或增加了不同機制的單個菌株聯(lián)用的生物產品(包括多個生物防治劑聯(lián)用制劑)的防效。宏基因組法可能有助于弄清楚此群落的結構和群落中單個成分間，群落和寄主植物間，病原菌和生物防治劑間的相互作用機制。要確保防治策略的成功需要具備病原菌和生物防治劑的生態(tài)學知識，以及環(huán)境因素對二者的影響。更好地了解這些方面對開發(fā)防治病原菌的生物方法很重要。關于獲前生物防治產毒素的真菌來說，宏基因組法集中研究與作物有關的群落(如田間水果上天然存在的)，有助于發(fā)現(xiàn)用于降低貯存期毒素積累風險的真菌混用中的一個或多個培養(yǎng)菌株。根據當前的法規(guī)，作為植物保護產品的真菌混用登記要求登記每個生物和整個真菌混用產品，其高昂的費用讓大型農化公司都望而卻步。

另一方面，可用基因編輯技術，特別是如刪除(CRISPRCas9)等致突變技術提高有益菌株防效。當然，還沒有有關這些策略——真菌聯(lián)盟和被編輯的菌株歸宿的信息，這些策略的應用將取決于立法限制/支持以及最后大眾的接受程度。