劉滿光,路文雅,李國(guó)松

(1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院,河北 石家莊050061;2.河北省林木良種工程技術(shù)中心,河北 石家莊050061;3.河北省林木種苗管理站,河北 石家莊050091)

油松 (Pinus tabulaeformis)四季常青,樹形美觀,是中國(guó)北方極具價(jià)值的造林和綠化樹種,但常常受到松樹枯梢病的危害。松樹枯梢病又稱爛皮病、潰瘍病,是植物侵染性病害,主要危害油松、赤松 (Pinus densiflora Sieb.et Zucc.)和黑松 (Pinus thunbergii Parl.)等,其主要癥狀為油松頂芽枯死、枯枝、枯梢以及枯萎,此外,還表現(xiàn)出樹干流脂、潰瘍、壞死以及木材藍(lán)變和根莖腐爛等癥狀[2],常伴有黃點(diǎn)枯針病和赤枯病[1]發(fā)生。目前,防治松樹枯梢病的主要方法為化學(xué)防治,其是林間常用的防控方法[3-4]。但化學(xué)防治的高毒藥劑不僅會(huì)造成環(huán)境的污染,對(duì)天敵和人畜都不安全,所以尋找防治松樹枯梢病的高效低毒藥劑具有重要意義。

近年來,人們發(fā)現(xiàn)了一些低毒甚至無(wú)毒的無(wú)機(jī)化合物,這些化合物在防治病害及抑菌方面都表現(xiàn)出很好的優(yōu)勢(shì)及前景。據(jù)報(bào)道,亞磷酸鉀鹽具有明顯的殺菌效果,其中亞磷酸氫二鉀和亞磷酸二氫鉀是多種殺菌劑及肥料的活性成分,對(duì)玉蜀黍赤霉(Ascomycetes)、瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、禾谷絲核菌 (Rhizoctonia zeae)及核盤菌 (Sclerotinia sclerotiorum)有明顯的抑制效果[5];此外,研究表明硼酸也有抑菌作用,例如硼酸對(duì)由灰霉菌 (Botrytis cinerea)導(dǎo)致的葡萄灰霉病有明顯的抑菌效果[6],并且能夠抑制由鏈核盤菌 (Monilinia laxa)導(dǎo)致的桃褐腐病[7]和由膠胞炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)導(dǎo)致的芒果炭疽病[8]等。但亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀對(duì)油松枯梢病菌 (Sphaeropsis sapinea)的影響還未見報(bào)道。

因此,本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法和凹玻片法測(cè)定亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑菌活性,研究4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑菌效果,旨在為松樹枯梢病的防治提供新思路,同時(shí)為亞磷酸、硼酸、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀這4種藥劑的抑菌潛力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1.1.1 供試菌株

油松枯梢病的病菌分離自油松枯梢病的病枝,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實(shí)驗(yàn)室提供,編號(hào)為KU571453;發(fā)病油松松針采自秦皇島聯(lián)峰山公園。

1.1.2 供試藥劑

硼酸 (H3BO3)由天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn),純度≥99.5%。亞磷酸 (H3PO3)由山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn),純度為99%。亞磷酸二氫鉀 (H2KO3P)由天津希恩思生化科技有限公司生產(chǎn),純度為98%。亞磷酸氫二鉀 (K2HPO3)由天津希恩思生化科技有限公司生產(chǎn),純度為98%。

1.1.3 儀器設(shè)備

使用的儀器設(shè)備包括超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、人工氣候箱、電子天平、移液槍等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基制備方法 馬鈴薯(Solanum tuberosum)(去皮)200g洗凈切成小塊,加入1 000mL蒸餾水煮30min,雙層紗布過濾,加蒸餾水定容至1 000mL,然后加入葡萄糖20g,瓊脂15-20g,加熱待瓊脂完全融開后,倒入錐形瓶中,用封口膜封口,高壓滅菌備用。

1.2.2 藥劑溶液配制

在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行,分別稱取4種待測(cè)藥劑放入滅菌小燒杯中,用無(wú)菌水溶解稀釋,根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,將其配成相應(yīng)濃度梯度的母液備用。

1.2.3 孢子懸浮液的制備

將采來的發(fā)病油松松針用無(wú)菌水沖洗干凈后,0.1%的升汞表面消毒30s,無(wú)菌水沖洗3次后,放置在無(wú)菌培養(yǎng)皿中,用接種針將其成熟的分生孢子器挑下來,輕輕按壓,并加入適量無(wú)菌水浸泡,使分生孢子完全釋放于無(wú)菌水中,配成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液,保存于-4℃冰箱中備用。

1.2.4 供試藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作環(huán)境下,采用菌絲生長(zhǎng)速率法[9],將10mL母液倒入溫度為50-60℃滅菌溶融狀態(tài)的90mL的PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi),冷卻凝固后,將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3d的松樹枯梢病菌用直徑5mm的打孔器在距菌落中心3cm處打取菌餅,然后接種于含藥PDA培養(yǎng)基中央,并置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng),3d、5d、7d后,以十字交叉法測(cè)量菌落直徑取平均值。每處理重復(fù)3次,以加10mL無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照。通過以下公式計(jì)算藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率:I=(D0-D1)/D0×100%,式中,I為抑制率,D0為空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑,D1為藥劑處理菌落增長(zhǎng)直徑。

1.2.5 供試藥劑對(duì)孢子萌發(fā)的影響

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,用無(wú)菌水配制成不同濃度梯度的供試藥液,采用凹玻片法[10],將孢子懸浮液及配好的供試藥液各20μL,滴于蓋玻片上混勻,翻轉(zhuǎn)平放于凹玻片凹槽上,放在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,用保鮮膜封上進(jìn)行保濕,并置于25℃培養(yǎng)箱中恒溫光照培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù),以無(wú)菌水為對(duì)照。每隔8h鏡檢1次,每個(gè)載玻片觀察5個(gè)視野,記錄孢子萌發(fā)數(shù)量,計(jì)算萌發(fā)率及萌發(fā)抑制率。以萌發(fā)出的芽管長(zhǎng)度大于孢子直徑長(zhǎng)度(指直徑最小的一邊)的一半時(shí)計(jì)為萌發(fā)。孢子萌發(fā)率 (%)=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100;孢子萌發(fā)抑制率 (%)=對(duì)照孢子萌發(fā)量-處理孢子萌發(fā)量/對(duì)照孢子萌發(fā)量×100。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

采用Excel軟件整理錄入數(shù)據(jù),用DPS、SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并計(jì)算各藥劑的毒力回歸方程和EC50值 (半最大效應(yīng)濃度)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用,抑制率均隨各藥劑濃度的增加而增大,且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。即各藥劑濃度對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)的抑制率在第3d最高。第3d,濃度為0.5g/L的亞磷酸對(duì)油松枯梢病的抑制率為97.16%,濃度為10g/L的硼酸對(duì)油松枯梢病的抑制率為79.2%,濃度為28g/L的亞磷酸二氫鉀及亞磷酸氫二鉀對(duì)油松枯梢病的抑制率分別為98.77%和95.51%。

表1 不同藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of four fungicides on the mycelial growth of S.sapinea

2.2 4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力測(cè)定分析

由表2可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)油松枯梢病抑制率的EC50值均隨時(shí)間的增加而增大,說明其持效性較差。即各藥劑對(duì)油松枯梢病抑制率的EC50值在第3d最小,其中亞磷酸的EC50值最小,為0.374,硼酸的EC50值為1.669,亞磷酸二氫鉀的EC50值為6.136,亞磷酸氫二鉀的EC50值最大,為7.360。

由此可知,4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用,抑制作用由強(qiáng)到弱為亞磷酸＞硼酸＞亞磷酸二氫鉀＞亞磷酸氫二鉀,并且亞磷酸的速效性和持效性都優(yōu)于其他3種藥劑。

表2 不同藥劑對(duì)油松枯梢病病菌菌絲生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力測(cè)定Tab.2 The toxicity of four fungicides on mycelial growth of S.sapinea in laboratory

2.3 不同藥劑對(duì)松樹枯梢病孢子萌發(fā)的影響

由表3可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)油松枯梢病的孢子萌發(fā)率均有抑制作用,抑制率均隨各藥劑濃度的增加而增大,且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。即各藥劑濃度對(duì)油松枯梢病孢子萌發(fā)的抑制率在24h最高。濃度為2g/L的亞磷酸對(duì)油松枯梢病的抑制率在24h為99.41%,濃度為3g/L的硼酸對(duì)油松枯梢病的抑制率在24h為99.54%,濃度為22.4g/L亞磷酸二氫鉀及亞磷酸氫二鉀對(duì)油松枯梢病的抑制率在24h分別為75.87%和50.84%。

表3 4種藥劑對(duì)油松枯梢病孢子萌發(fā)的影響Tab.3 Effect of four fungicides on spore germination of S.sapinea

2.4 不同藥劑對(duì)油松枯梢病孢子萌發(fā)室內(nèi)毒力測(cè)定分析

由表4可以看出,亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀和亞磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)油松枯梢病孢子萌發(fā)抑制率的EC50值均隨時(shí)間的增加而減小,說明持效性好,即各藥劑對(duì)油松枯梢病孢子萌發(fā)抑制率的EC50值在24h最小,其中亞磷酸的EC50值最小,為0.587,硼酸的EC50值為1.043,亞磷酸二氫鉀的EC50值為4.636,亞磷酸氫二鉀的EC50值最大,為19.058。結(jié)果表明,4種藥劑對(duì)油松枯梢病孢子萌發(fā)均有抑制作用,且抑制作用由強(qiáng)到弱為亞磷酸＞硼酸＞亞磷酸二氫鉀＞亞磷酸氫二鉀,其中亞磷酸的速效性最好。

3 結(jié)論與討論

松樹枯梢病是松樹上比較嚴(yán)重的病害,不僅影響松樹生長(zhǎng),還影響它的觀賞價(jià)值,選擇防治松樹枯梢病的高效低毒藥劑可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)化學(xué)藥劑的不足。本研究對(duì)亞磷酸、硼酸、磷酸二氫鉀以及磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)油松枯梢病的影響結(jié)果表明,4種藥劑對(duì)油松枯梢病菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用,且菌絲生長(zhǎng)抑制率的篩選結(jié)果與對(duì)孢子萌發(fā)抑制率的篩選結(jié)果大致相同,抑制作用由強(qiáng)到弱依次為亞磷酸、硼酸、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。

亞磷酸對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制效果最好,但其抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。硼酸對(duì)松樹枯梢病的抑制作用也較好,其抑菌機(jī)理可能是通過引起病原菌細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝紊亂,破壞線粒體的功能,導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷,抑制病原菌細(xì)胞外水解酶的分泌[11-19]。Qin等[6]的研究表明,硼酸能夠直接破壞病原菌的質(zhì)膜,導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏。亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀對(duì)松樹枯梢病的抑制作用則可能是因?yàn)閬喠姿猁}不僅可以直接作用于病原菌,還能刺激宿主產(chǎn)生防御反應(yīng)[20]。雖然本研究中亞磷酸和硼酸對(duì)松樹枯梢病菌的抑制作用較強(qiáng),但在實(shí)際應(yīng)用中,亞磷酸有腐蝕性,對(duì)皮膚及呼吸道均有刺激性,所以要慎重使用,而硼酸也能夠刺激皮膚,其生物安全性需要進(jìn)一步探討評(píng)估。

本研究為亞磷酸、硼酸、亞磷酸二氫鉀以及亞磷酸氫二鉀4種藥劑對(duì)松樹枯梢病的防治奠定了基礎(chǔ),之后可以對(duì)4種藥劑的抑菌作用機(jī)制以及各種抑菌物質(zhì)的復(fù)配效果進(jìn)行探索研究。但本研究?jī)H在室內(nèi)完成,其林間應(yīng)用效果以及未來的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還需要進(jìn)一步的林間試驗(yàn)。