朱秀靈，戴清源，木朝麗，蔡為榮，郭玉寶，許祚文，張志祥，汪建飛（.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 4000；.蕪湖益然香木榨食用油有限公司，安徽蕪湖 400）

0 引言

芝麻（Sesamum indicum L.）是最古老的油料作物之一，富含油脂（50%以上）、蛋白質(zhì)（約25%）及抗氧化物質(zhì)，如芝麻素、芝麻林素、生育酚等。除被用于生產(chǎn)芝麻油外，也廣泛用于糖果糕點(diǎn)、焙烤食品，在醫(yī)藥領(lǐng)域也有潛在的應(yīng)用前景[1-2]。

長期以來，芝麻深受消費(fèi)者青睞與其對人體的營養(yǎng)健康作用密不可分。芝麻木酚素是芝麻中最有營養(yǎng)價(jià)值的成分之一，具有促進(jìn)乙醇代謝、肝解毒、調(diào)節(jié)血脂、降血壓、抗氧化及抗癌等生理活性[3-4]。因此，高含量的芝麻木酚素通常被作為芝麻品種選育的指標(biāo)之一。芝麻木酚素包括脂溶性的芝麻素、芝麻林素及水溶性的芝麻素酚三糖苷、二糖苷、單糖苷等，其中以芝麻素（0.67～12.76 mg/g）、芝麻林素（0.20～6.96 mg/g）、芝麻素酚三糖苷 （0.68～6.40 mg/g）含量居高[4-8]。芝麻木酚素含量因地區(qū)、品種、顏色等因素的影響而有很大差異[8]。此外，芝麻中天然存在的木酚素及酚類物質(zhì)是否與芝麻抗氧化能力相關(guān)，近年來也引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，黑芝麻抗氧化能力強(qiáng)于白芝麻，但是抗氧化能力的強(qiáng)弱與芝麻素、芝麻林素含量之間沒有相關(guān)性[2，9]；芝麻素在體外的抗氧化能力較弱，但芝麻素的存在增強(qiáng)了γ-生育酚的抗氧化活性[10]；芝麻抗氧化活性與芝麻中酚類物質(zhì)可能有一定的關(guān)系[11]。芝麻抗氧化能力與芝麻木酚素含量及總酚含量是否相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

我國是芝麻生產(chǎn)及消費(fèi)大國，安徽省是芝麻種植面積較大的省份之一，芝麻種植面積和產(chǎn)量僅次于河南省，居全國第2位[12]。目前，有關(guān)安徽不同產(chǎn)地芝麻中木酚素含量、總酚含量及抗氧化能力的研究報(bào)道較少。以安徽不同產(chǎn)地芝麻為原料，測定芝麻中木酚素及總酚含量、評(píng)價(jià)芝麻提取物的抗氧化能力、探討芝麻木酚素及總酚含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性，對于正確認(rèn)識(shí)芝麻活性成分的保健作用并合理利用芝麻資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：分別于2016年7月—12月購買安徽不同產(chǎn)地農(nóng)戶自行種植的芝麻共22份，日光曬至水分含量5.5%～6.0%，密封袋密封，于-18℃條件下存放。

試劑：沒食子酸（99%純度）、甲醇（色譜純）、福林酚試劑（BR級(jí)），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、芝麻素、芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC純度98%以上），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC純度98%以上。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100型萬能粉碎機(jī)、SHA-S型往返式氣浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；L-550型臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-Ⅲ型多功能循環(huán)水真空泵，鄭州上街華科儀器廠產(chǎn)品；ZFD-A5140型鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；UV-5800PC型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；LC-2010型液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；IMark酶標(biāo)儀，美國BioTek公司產(chǎn)品。

1.3 芝麻提取物的制備

芝麻經(jīng)日光曬干（水分含量5.5%～6.0%），經(jīng)萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。按料液比1∶10（g∶mL）加入90%甲醇，于氣浴振蕩器中于室溫下振蕩浸提3 h，離心（4 500 r/min，10 min），收集浸提液，沉淀部分以相同方法浸提2次，將3次浸提液混合并減壓濃縮、真空干燥，即得芝麻提取物。稱取22份芝麻提取物各10 mg用90%甲醇溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液分別用于木酚素、總酚含量和抗氧化能力分析。

1.4 芝麻中木酚素含量的測定

木酚素含量的測定采用高效液相色譜法，色譜條件如下：TSKgel ODS-80TsQA型（4.6 mm×250 mm）色譜柱，紫外檢測器，檢測波長290 nm，流動(dòng)相：甲醇/水由初始10/90（mL/mL） 在60 min梯度變化為90/10（mL/mL），流速0.8 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL，每個(gè)樣品檢測時(shí)間70 min。

精確稱取芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，芝麻素和芝麻林素分別用甲醇溶解并定容至25 mL，芝麻素酚三糖苷用90%甲醇溶解并定容至25 mL，分別得到400 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。然后將標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋得到質(zhì)量濃度為5，20，40，80，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別進(jìn)行高效液相色譜檢測。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

芝麻木酚素含量采用高效液相色譜檢測，根據(jù)保留時(shí)間是否與標(biāo)準(zhǔn)品一致進(jìn)行定性分析，根據(jù)木酚素對應(yīng)的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出待測溶液中各木酚素質(zhì)量濃度。芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷的含量分別按公式（1）計(jì)算。芝麻總木酚素含量為三者之和。

式中：ω——分別表示芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷的含量，mg/g；

C——分別表示待測液中芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷的質(zhì)量濃度，μg/mL，由對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得；

V——待測液的體積，mL；

m0——芝麻質(zhì)量，g。

1.5 芝麻中總酚含量的測定

總酚含量的測定采用福林酚法[13]，準(zhǔn)確量取芝麻提取物各0.5 mL，分別加入1.0 mL 0.1mol/L福林酚試劑，混勻，再加入4.0 mL飽和碳酸鈉溶液，混勻，避光靜置2 h，于波長765 nm處測定吸光度。以沒食子酸（GAE）為標(biāo)準(zhǔn)，總酚含量以每克芝麻提取物含有沒食子酸毫克數(shù)（mg GAE/g）表示。

1.6 芝麻提取物抗氧化能力

芝麻提取物抗氧化能力參照文獻(xiàn)[14]，方法如下：精確稱取10.0 mg DPPH自由基，用甲醇溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中，然后用甲醇稀釋配成濃度為1×10-4mol/L DPPH自由基溶液，于4℃冰箱中避光保存。將芝麻提取物分別用90%甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg/mL，各量取30 μL，分別加入到96孔板中，每孔再分別加入240 μL甲醇和30 μL DPPH自由基溶液，混勻，于室溫下避光靜置30 min，然后用酶標(biāo)儀于波長540 nm處測定吸光度?？瞻滓?0%甲醇取代樣品，則芝麻提取物對DPPH自由基清除率：

式中：d——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白對照于波長540 nm處吸光度；

Asample——待測樣品于波長540 nm處吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V22.0（IBM-SPSS，USA） 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、制圖、方差分析和顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 安徽不同產(chǎn)地芝麻中木酚素含量比較

芝麻林素、芝麻素、芝麻素酚三糖苷及芝麻提取物的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及芝麻提取物的高效液相色譜圖

以峰面積Y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=37.167X-11.392（R2=0.998 6），Y=31.642X-20.491 （R2=0.998 9）， Y=11.093X+18.076（R2=0.997 8），線性范圍 5～100 μg/mL。由公式（1）計(jì)算得出安徽不同產(chǎn)地芝麻中芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚三糖苷含量。

芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力見表1，黑白2組芝麻木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力見表2。

表1 芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力

表2 黑白2組芝麻木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基的清除能力

由表1和表2可知，安徽不同產(chǎn)地芝麻中芝麻素含量范圍2.16～7.37 mg/g，芝麻林素1.09～3.73 mg/g，芝麻素酚三糖苷 0.46～2.76 mg/g，總木酚素 3.93～12.43 mg/g，平均含量分別為4.64±1.65，2.50±0.78，1.78±0.65，8.87±2.86 mg/g。芝麻素、芝麻素酚三糖苷的平均含量均高于文獻(xiàn)[15]芝麻素含量380.6±20.4 mg/100 g，芝麻素酚三糖苷含量68.4 mg/100 g以及文獻(xiàn)芝麻素含量4.34 mg/g和芝麻素酚三糖苷含量1.09 mg/g，但低于文獻(xiàn)[7]芝麻素5.24 mg/g及文獻(xiàn)[2]芝麻素酚三糖苷640±317 mg/100 g。研究中芝麻林素平均含量2.50±0.78 mg/g低于文獻(xiàn)[15]（276.5±13.8 mg/100 g），文獻(xiàn)[7]（3.30 mg/g） 但高于文獻(xiàn)[2]（2.27 mg/g） 報(bào)道。

黑白2組芝麻相比，白芝麻中芝麻素含量范圍4.47～7.37 mg/g（平均含量為 5.91±0.90 mg/g），芝麻林素 2.37～3.33 mg/g（平均含量為 2.90±0.32 mg/g），芝麻素酚三糖苷1.72～2.61 mg/g（平均含量為2.19±0.30 mg/g），總木酚素9.61～12.32 mg/g（平均含量為11.01±0.83 mg/g）；而黑芝麻中這幾種木酚素含量范圍分別為 2.16～5.94，1.09～3.37，0.46～2.76，3.93～12.43 mg/g，平均含量分別為3.36±1.15，2.10±0.89，1.36±0.65，6.73±2.53 mg/g。Rangkadilok N 等人[4]分析泰國黑芝麻和白芝麻中芝麻素含量分別為0.05～4.71 mg/g 和 0.74～7.23 mg/g，其中芝麻素含量最高的品種是中國白芝麻；與白芝麻相比，泰國黑芝麻中芝麻林素含量較低，不超過1.28 mg/g。試驗(yàn)中黑芝麻各木酚素平均含量均低于白芝麻，這與文獻(xiàn)[2，7]報(bào)道基本一致。

黑白2組芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力方差分析見表3。

由表3可知，黑白2組芝麻中芝麻素、芝麻素酚三糖苷及總木酚素含量差異極顯著（p＜0.01），芝麻林素含量差異顯著 （0.01＜p＜0.05），這與文獻(xiàn)[2，7]報(bào)道基本一致。黑白芝麻木酚素含量差異可能與品種、遺傳因素、生長環(huán)境（土壤、氣候、光照、肥料）、粒徑大小、蒴果分布、收獲時(shí)間、貯藏時(shí)間、提取溶劑及檢測方法等因素有關(guān)[2，4]。

表3 黑白2組芝麻中木酚素、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力方差分析

芝麻中木酚素含量、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力相關(guān)性分析見表4。

由表4可知，芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷與總木酚素含量之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.957，0.872，0.867，在0.01水平上顯著；芝麻素與芝麻林素、芝麻素與芝麻素酚三糖苷、芝麻林素與芝麻素酚三糖苷之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.722，0.740，0.799，在0.01水平上顯著。結(jié)果表明，安徽不同產(chǎn)地22種芝麻中各木酚素含量之間顯著正相關(guān)，這與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的芝麻素和芝麻林素含量呈顯著正相關(guān)基本保持一致，其原因在于芝麻素和芝麻林素具有相似的生物合成途徑，但文獻(xiàn)卻報(bào)道芝麻中各木酚素含量之間沒有相關(guān)性。

表4 芝麻中木酚素含量、總酚含量及芝麻提取物對DPPH自由基清除能力相關(guān)性分析

2.2 安徽不同產(chǎn)地芝麻中總酚含量比較

芝麻中總酚含量采用福林酚法測定（見表1）。采用SPSS V22.0軟件對表1數(shù)據(jù)比較均值（見表2）及方差分析（見表3）。由表2可知，芝麻中總酚含量為 3.13～3.97 mg GAE/g，平均含量為 3.60±0.28 mg GAE/g；黑白2組芝麻中總酚含量分別為3.13～3.95，3.25～3.97 mg GAE/g，平均含量分別為3.49±0.30，3.71±0.22 mg GAE/g，黑白2組芝麻中總酚含量差異不顯著（p=0.068＞0.05），說明黑白2種顏色芝麻中總酚含量沒有明顯差異。安徽地區(qū)白芝麻中總酚含量變化范圍大于Lin X等人報(bào)道的范圍3.70～7.86 mg GAE/g，其原因可能與芝麻品種、生長環(huán)境及提取檢測條件有關(guān)。研究中黑白2組芝麻中總酚含量沒有顯著差異，這與Shahidi F等人[9]報(bào)道不一致，他們采用80%乙醇浸提黑芝麻和白芝麻，所得提取物中總酚含量分別為29.9±0.6，10.6±1.6 mg/g（以每1 g提取物中毫克兒茶素當(dāng)量計(jì)），黑芝麻提取物中總酚含量約是白芝麻的5倍。然而通過比較山西省3種黑芝麻和白芝麻總酚含量，黑白芝麻中總酚含量分別為 4.54～7.32 mg GAE/g，3.56～4.04 mg GAE/g，白芝麻中總酚含量高于黑芝麻，但二者之間差異不顯著。

2.3 安徽不同產(chǎn)地芝麻提取物對DPPH自由基清除能力比較

DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更加穩(wěn)定[10]，因此DPPH自由基清除能力常被用作評(píng)價(jià)抗氧化能力的一種方法。研究采用DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)安徽不同產(chǎn)地芝麻提取物的抗氧化活性，結(jié)果見表1和表2。22種芝麻提取物對DPPH自由基清除率范圍為65.34%～81.44%，黑白2組芝麻提取物對DPPH自由基清除率范圍分別為65.34%～81.44%和66.42%～79.19%，2種顏色相比，黑芝麻提取物對DPPH自由基清除率范圍及平均清除率均大于白芝麻，但差異不顯著（p=0.680＜0.05，見表3）。這可能是由于提取溶劑、芝麻品種及生長環(huán)境條件不同，芝麻提取物中抗氧化物質(zhì)含量不同，對DPPH自由基清除能力也會(huì)有所不同[2]。

眾多學(xué)者認(rèn)為芝麻提取物的抗氧化活性與抗氧化成分（如芝麻素、芝麻林素及酚類物質(zhì)）有關(guān)，但也有研究報(bào)道芝麻提取物的抗氧化活性與芝麻木酚素含量沒有直接關(guān)系[2]。研究針對DPPH自由基清除能力是否與芝麻木酚素及總酚含量相關(guān)進(jìn)行了分析（見表4）。由表4可知，芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及總木酚素含量與DPPH自由基清除率之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.228，0.319，0.279，0.289，在0.05及0.01水平均不顯著，說明芝麻中各木酚素與DPPH自由基清除能力沒有相關(guān)性，這與Kumar C M等人[10]報(bào)道基本一致。芝麻中總酚含量與DPPH自由基清除率之間的相關(guān)系數(shù)為0.543，在0.01水平顯著，說明芝麻中總酚含量與DPPH自由基清除能力顯著相關(guān)，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。

3 結(jié)論

采用HPLC法測定安徽不同產(chǎn)地22種芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷含量，采用福林酚法測定芝麻中總酚含量、DPPH自由基清除活性評(píng)價(jià)芝麻提取物的抗氧化能力。22種芝麻中芝麻素、芝麻林素及芝麻素酚三糖苷含量分別為2.16～7.37，1.09～3.73，0.46～2.76 mg/g。黑白 2 組芝麻相比，黑芝麻中芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚三糖苷及總木酚素含量顯著低于白芝麻，各木酚素含量之間呈顯著正相關(guān)。22種芝麻中總酚含量為3.13～3.97 mg/g。黑白2組芝麻相比，總酚含量差異不顯著。芝麻中總酚含量與各木酚素含量呈顯著正相關(guān)。22種芝麻提取物對DPPH自由基清除率為65.34%～81.44%，黑芝麻提取物對DPPH自由基清除能力高于白芝麻提取物，但差異不顯著。22種芝麻提取物對DPPH自由基清除能力與各木酚素含量無相關(guān)性，但與芝麻中總酚含量呈顯著正相關(guān)。

芝麻作為傳統(tǒng)健康食品，深受消費(fèi)者青睞，其健康作用與木酚素含量、總酚含量及芝麻提取物的抗氧化能力是否相關(guān)，一直備受關(guān)注。由于芝麻品種、生長環(huán)境、氣候條件、田間管理、貯藏時(shí)間等因素的影響，芝麻木酚素及總酚含量可能存在不同程度的差異。目前，抗氧化能力體外測定常用方法主要有以脂質(zhì)氧化降解為基礎(chǔ)的方法（如過氧化值法、硫代巴比妥酸反應(yīng)物法、硫氰酸鐵法等）、以清除自由基為基礎(chǔ)的方法（如DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子等清除能力）、螯合過渡金屬防止產(chǎn)生自由基的方法（如鐵離子螯合能力、銅離子螯合能力等）、測定待測物的還原能力的方法（如鐵離子還原能力、銅離子還原能力）及其他方法（如電化學(xué)法、高效液相色譜法等）[16]。由于沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，所以在研究物質(zhì)的抗氧化能力時(shí)，所采用的方法因研究者偏好及試驗(yàn)條件的影響而不同。與羥基自由基、超氧自由基相比，DPPH自由基穩(wěn)定[10]，因此DPPH自由基清除能力常被用作評(píng)價(jià)抗氧化能力的一種方法，這也是試驗(yàn)采用DPPH自由基清除活性評(píng)價(jià)芝麻提取物的抗氧化能力的原因之一，但也存在著方法單一、測定結(jié)果不能與其他測定方法相比較等問題，因此有關(guān)芝麻提取物的抗氧化能力有待于結(jié)合多種測定方法進(jìn)一步深入研究。