納米明膠硅氧烷的制備及其負(fù)載p53基因?qū)Ω伟┮种菩Ч?/h1>
2018-08-24 01:37:16，，，，，
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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)
0 引 言
原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性腫瘤，是世界上第五大常見癌癥，也是世界上癌癥死亡率較高的主要疾病之一[1]，在發(fā)展中國家，HCC發(fā)生率超過80%并在男性發(fā)病率中居第二位[2]。目前，治療肝癌有許多方法，包括手術(shù)切除、化療、局部消融和肝移植，但大多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)展成為晚期不適合手術(shù)，且這些方法也存在顯著的毒性和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。目前在大多數(shù)國家中仍缺乏有效的治療方法，HCC的死亡率幾乎等于發(fā)病率[6]。因此，開發(fā)一種在提高肝癌患者預(yù)后能力和盡量減少與治療相關(guān)的毒性的治療方法是非常迫切的。
基因治療作為一種新興的治療方法，是依賴某種載體遞送核酸如質(zhì)粒DNA、siRNA和miRNA等進(jìn)入患者細(xì)胞從而達(dá)到治療目的[7]，現(xiàn)已被廣泛認(rèn)為是治療許多疾病的有效方法，如心血管[8]、遺傳性疾病[9]、神經(jīng)性疾病[10]、惡性腫瘤[11]以及多基因誘導(dǎo)疾病如血友病[12]和肌肉萎縮癥[13]等。迄今為止，近2600個(gè)基因治療臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成并在全球獲得批準(zhǔn)[14]。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及人類基因組工程的完成，人類疾病DNA基因組學(xué)的深入研究，通過基因治療手段來治愈疾病的新模式策略也越來越為人所接受，但選擇一種高效、安全的基因載體和治療基因仍然是成功基因治療的巨大挑戰(zhàn)。
p53蛋白作為腫瘤抑制因子可參與多種細(xì)胞反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、自噬、代謝、mRNA翻譯和反饋機(jī)制等方面起著重要作用[15]。p53基因的突變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，超過50%的癌癥(包括HCC)是由p53基因突變引起的[16]。用腺病毒作為基因載體重新引入野生型p53基因已經(jīng)達(dá)到臨床水平，其中也包括對HCC的治療[17-18]。脂質(zhì)體[15]和陽離子聚合物[19]的非病毒載體也越來越多地被用于p53基因傳遞治療HCC，引入野生型p53誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而成為癌癥基因治療的一種新手段。
明膠硅氧烷納米顆粒(Gelatin siloxane nanoparticles，GS NPs)具有低毒性、可降解性、表面易吸附、易修飾性以及易重復(fù)合成等優(yōu)點(diǎn)，作為生物材料已被廣泛用于骨組織工程[20]、腦疾病治療[21-22]和基因藥物載體[23-24]等研究。由于GS NPs表面帶有較大量的正電荷，可作為一種潛在的基因載體材料，介導(dǎo)目的基因進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)，但對于GS NPs負(fù)載治療基因?qū)Π┘?xì)胞的效果卻鮮有報(bào)道。本文采用溶膠-凝膠法探究不同的pH值鹽酸溶液對納米明膠硅氧烷制備的影響及其作為基因載體負(fù)載p53基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制效果。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
a) 材料：pEGFP-C1-p53(p53)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室所保存，明膠(100 g，美國BBI公司)，GPSM(3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)、APTMS((3-氨丙基)三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)，F(xiàn)ITC(異硫氰酸熒光素，10 mg，美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒、MTT粉末、PI(碘化丙啶)粉末、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(均購自上海碧云天公司)，LysoTracker Blue DND-22、BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，p53抗體(0.1 mL，美國Novus公司)，β-actin抗體(0.1 mL，美國Affinity公司)，鼠二抗、ECL試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。
b) 儀器：場發(fā)射掃描電鏡(ZEISS-ULTRA55，日本Hitachi公司)，動(dòng)態(tài)光散射儀(LB-550 V，英國Malvern公司)，數(shù)顯控溫磁力攪拌器(78HW-3，杭州儀表電機(jī)有限公司)，凝膠成像儀(GGM/D2，GeneGenius公司)，酶標(biāo)儀(ELx 800，BioTek公司)，激光共聚焦顯微鏡(LSM710 3-channel，德國Zeiss公司)。
1.2 不同pH值條件下納米明膠硅氧烷的制備及表征
首先分別向20.0 mL的pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中加入0.15 g的明膠，40 ℃下加熱溶解，配成明膠溶液為0.75%。再向明膠溶液中分別加入0.20 g GPSM(185 μL)，于60 ℃，500 r/min的磁力恒溫?cái)嚢杵魃蠑嚢?0 min。然后向反應(yīng)體系中加入0.08 g APTMS(75 μL)，于60 ℃下繼續(xù)攪拌8～10 h。最后停止攪拌，以14000 r/min，20 ℃離心20 min，獲取白色沉淀，超聲分散水洗三遍后，以10.0 mL的ddH2O超聲波重新懸浮，即得到約4 mg/mL GS NPs懸浮液。
用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)對顆粒形貌進(jìn)行觀察，動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)分析其粒徑和表面Zeta電位。
1.3 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
選取pH值3.0鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，新鮮制備好的GS NPs重懸超聲分散，濃度為4 mg/mL，分別與pEGFP-C1-p53以10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1和200∶1的質(zhì)量比均勻混合，用ddH2O補(bǔ)齊體系，渦旋15 s，室溫孵育靜置60 min，即得到GS-p53納米復(fù)合物。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測GS-p53復(fù)合物中是否有pDNA溢出，評價(jià)納米顆粒對p53的包封效率。
1.4 納米復(fù)合物GS-p53的粒徑和表面Zeta電位分析
取新鮮制備的GS-p53納米復(fù)合物懸液，用ddH2O稀釋后加入1.2 mL至樣品池中，置于動(dòng)態(tài)光散射儀上測定其粒徑和Zeta電位。
1.5 對p53基因的釋放性
按1.3中方法制備復(fù)合物懸液(質(zhì)量比為200∶1)，分成3等份，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)后，棄上清液，分別超聲重懸于相同體積的50、150 mmol/L和300 mmol/L的NaCl溶液中，并均置于200 r/min，37 ℃的搖床中振蕩30、60 min和120 min后，每組取出等體積的復(fù)合物懸浮液離心分離，進(jìn)行凝膠電泳檢測上清液中是否有p53溢出。
1.6 納米明膠硅氧烷的生物相容性
本文采用CCK-8試劑盒檢測GS NPs對肝細(xì)胞的毒性。納米顆粒的無菌處理：將新鮮制備的GS NPs，14 000 r/min，20 ℃，離心20 min后棄上清，75%酒精超聲重懸至相同濃度，消毒30 min后，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)，用無菌水水洗三次，超聲分散到無血清培養(yǎng)基中，得到1 mg/mL的使用液，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)濃度要求稀釋。
取對數(shù)生長期的人肝正常細(xì)胞L-02以每孔100 μL，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，并放置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長良好后更換為含有不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)GS NPs的無血清培養(yǎng)基，其中每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別共培養(yǎng)24、48 h和72 h后，吸除舊培養(yǎng)液并用PBS洗兩次，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。避光加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1～2 h后，酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處的各孔吸光值(OD值)，并根據(jù)式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率：
(1)
其中：X為細(xì)胞存活率；OD2為實(shí)驗(yàn)組的OD值；OD1為對照組的OD值；OD0為Blank組的OD值。
1.7 GS-p53細(xì)胞內(nèi)攝取情況
熒光標(biāo)記的納米顆粒(FITC-GS NPs)的制備：取新鮮制備的GS NPs重懸于pH 值8.0的磷酸緩沖液中配成2～5 mg/mL的濃度。以GS NPs/FITC的比例為300∶1加入FITC溶液，避光室溫振蕩反應(yīng)1～2 h。14,000 r/min，20 ℃離心20 min后，棄上清，ddH2O超聲洗滌三次，得到FITC-GS NPs。熒光標(biāo)記的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物的制備：先將p53用PI進(jìn)行標(biāo)記，將質(zhì)粒p53與PI以1∶1比例混勻，室溫避光孵育20 min后，即得到PI-p53質(zhì)粒。然后將FITC-GS NPs與PI-p53質(zhì)粒按1.3中的方法混合后離心棄上清(質(zhì)量比為200∶1)，即得到FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物。激光共聚焦樣品制備：取1.0 mL對數(shù)生長期、5×104個(gè)/mL的Hep-3b細(xì)胞接種于35 mm玻底培養(yǎng)皿(共聚焦專用培養(yǎng)皿)中，待細(xì)胞貼壁生長良好后，PBS洗滌兩次，更換為900 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，避光加入100 μL新鮮制備、2 mg/mL的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物懸液，分別共培養(yǎng)6 h和24 h。吸去舊培養(yǎng)液，PBS清洗兩次。更換為1.0 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入50 μL 1 μmol/L LysoTracker Blue(標(biāo)記溶酶體)染色液繼續(xù)孵育2 h。去除舊培養(yǎng)基，PBS洗滌三次，每次清洗3～5 min。加入1.0 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min。去除固定液，PBS洗滌三次。于玻底滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，4 ℃黑暗環(huán)境下短時(shí)間保存。所有操作均需避光。激光共聚焦顯微鏡下觀察：綠色代表GS NPs，紅色代表p53質(zhì)粒，藍(lán)色代表溶酶體細(xì)胞器。
1.8 GS-p53對肝癌細(xì)胞的抑制效果
本文采用MTT法檢測GS-p53處理后，肝癌細(xì)胞的存活率情況。取生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞Hep-3b消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培液，加入不同處理組的無血清培養(yǎng)液：裸p53、GS NPs、GS-p53(每孔納米顆粒的終濃度為600 μg/mL，p53濃度3 μg/mL)，繼續(xù)共培養(yǎng)24、48 h后，PBS清洗兩次，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，小心吸除每孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，輕微振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率。
1.9 Western blot檢測p53蛋白表達(dá)水平
GFP-p53融合蛋白的收集：取對數(shù)生長期Hep-3b細(xì)胞以每孔2.0 mL培養(yǎng)基和2×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁良好后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，分別加入等量的p53和GS-p53(納米顆粒終濃度為1 mg/mL)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h后，棄盡舊培養(yǎng)液并用PBS清洗兩次，每孔加入100 μL RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min后收集并加入6×loading buffer于100 ℃金屬浴10 min，用于SDS-PAGE電泳或-20 ℃短期保存。
SDS-PAGE電泳：本文采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，按試劑盒操作說明配制SDS-PAGE。每孔加入50 μg蛋白樣品，Maker 5 μL，于80 V電壓下電泳至濃縮膠分離膠分界處時(shí)，加大電壓至120 V，電泳約1.5 h。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后以負(fù)膠正膜(負(fù)極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(甲醇活化20 s，正面朝下)-濾紙-海綿-正極)的順序組裝好并置入電轉(zhuǎn)槽中，加入4 ℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，于冰上轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，時(shí)間90 min。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST清洗三次，每次5 min，置于5%脫脂奶粉封閉液中，119 r/min室溫封閉2 h。抗體孵育并顯影：棄掉封閉液，加入10.0 mL一抗溶液(p53抗體以1∶1000比例稀釋，內(nèi)參β-actin以1∶3000比例稀釋)，119 r/min 4 ℃孵育過夜。TBST清洗四次，每次15 min，加入鼠二抗溶液(以1∶5000比例稀釋)，119 r/min室溫孵育2 h。TBST清洗四次后置于超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光檢測。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2.1 不同pH值條件下的GS NPs制備
為了探究溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中鹽酸溶液pH值的影響，本實(shí)驗(yàn)以不同pH值鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，分別研究pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液條件對GS NPs粒徑、表面Zeta電位和形貌的影響，結(jié)果如表1和圖1所示。表1結(jié)果顯示：pH值2.0鹽酸溶液中，反應(yīng)難以形成乳白色懸濁液即GS NPs；當(dāng)在pH值為3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中，反應(yīng)8～10 h均可得到乳白色懸濁液，因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs過程中，必須在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境中進(jìn)行，GPSM中環(huán)氧基團(tuán)才能和明膠的氨基反應(yīng)以形成明膠-GPSM化合物。隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，分散性系數(shù)由0.21增大到0.31，粒徑分布如圖1所示：pH值越小，粒徑分布越均勻，pH值3.0和4.0鹽酸條件下主要分布在200～400 nm，pH值5.0時(shí)分布較寬；Zeta電位并未因粒徑分布發(fā)生較大變化，穩(wěn)定在37～40 mV(表1)。以上結(jié)果表明，當(dāng)其他反應(yīng)條件不變時(shí)，鹽酸溶液的酸性越弱，制備的GS NPs平均粒徑越大，分布越寬，而對表面組成無較大影響，仍帶正電荷。
表1 不同pH值體系下GS NPs的粒徑、Zeta電位和分散性系數(shù)
注：pH值2.0鹽酸溶液下，未形成乳白色懸濁液即GS NPs。
圖1 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的粒徑分布
圖2為不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的場發(fā)射掃描電鏡圖。圖2(a)-(c)顯示，pH值大于2.0鹽酸環(huán)境下制備的GS NPs呈不規(guī)則的球形形貌，分散性較好，存在一種粒徑均一約50～100 nm的小顆粒。pH值越大，納米顆粒粒徑越大，鹽酸溶液pH值5.0時(shí)形成的粒徑約300 nm以上明顯比pH值3.0時(shí)大，pH值3.0和pH值4.0時(shí)形成的GS NPs粒徑較均一，約250～300 nm間，且pH值3.0下形成的較小顆粒相對于pH值4.0較多，可能導(dǎo)致pH值3.0平均粒徑相對較小。與粒徑DLS結(jié)果綜合分析，pH值3.0鹽酸溶液下制備的GS NPs分散性較好，平均粒徑較小，粒徑分布集中，表面帶有一定的正電位。
圖2 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的FE-SEM圖
2.2 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
為了定性分析GS NPs對pEGFP-C1-p53的包裹能力，對納米復(fù)合物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，隨著質(zhì)量比的逐漸增大，條帶亮度逐漸減弱，點(diǎn)樣孔的亮度逐漸增強(qiáng)，表明游離的p53逐漸減少，而在點(diǎn)樣孔中滯留的p53逐漸增多，說明納米顆粒的包裹能力隨著其含量的增加而增強(qiáng)。其中GS NPs在質(zhì)量比為30∶1時(shí)，未出現(xiàn)明顯條帶，表明GS NPs以30∶1的質(zhì)量比能很好地包裹住p53。
圖3 GS NPs對pEGFP-C1-p53的包封性檢測
注：泳道ND為裸p53；泳道1～6分別為GS NPs/p53質(zhì)量比為10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1。
2.3 GS-p53的粒徑和表面Zeta電位
對于非病毒基因載體來說，其粒徑和表面電位是影響細(xì)胞內(nèi)化效率和進(jìn)入細(xì)胞方式的重要影響因素[25]。通過對GS-p53納米復(fù)合物的粒徑和表面電位分析，分析其最適進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)量比復(fù)合，結(jié)果如圖4所示。圖4表明：GS NPs與p53復(fù)合后，表面電位呈現(xiàn)明顯的下降，其原因是納米顆粒負(fù)載p53質(zhì)粒是通過正負(fù)電荷靜電吸附作用使pDNA結(jié)合到納米顆粒表面，屏蔽納米顆粒表面的正電荷，導(dǎo)致了其表面電位的下降。GS NPs粒徑明顯呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)復(fù)合物表面電位為0左右，粒徑達(dá)到微米以上，說明復(fù)合物呈現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，此時(shí)質(zhì)量比30∶1，結(jié)合圖3中的GS NPs的包封性，推測其原因可能是當(dāng)質(zhì)量比為30∶1時(shí)，GS NPs剛好能最大比包裹住質(zhì)粒p53，從而導(dǎo)致復(fù)合物呈電中性，復(fù)合物間的同種電荷排斥力減弱，而呈現(xiàn)明顯的團(tuán)聚。由圖4還可知，隨著納米顆粒質(zhì)量比的增加，復(fù)合物表面電位大體呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，最后趨于穩(wěn)定，這表明隨著納米粒子的增多，其吸附能力越強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到一定包裹比例后，pDNA含量不會顯著影響其表面電位。而當(dāng)復(fù)合物表面電位穩(wěn)定于30 mV左右時(shí)，其粒徑仍有一定程度的增大，但總體小于400 nm，表明粒徑的增大主要是由于pDNA結(jié)合到納米顆粒表面引起的。納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞主要是由于表面正電荷與細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷分子的靜電相互作用而使其與膜結(jié)合，因此對于納米顆粒復(fù)合物來說，維持一定的正電荷是很有必要的，且在納米顆粒與p53質(zhì)量比為200∶1的條件下GS-p53具有較小的粒徑和一定的正電位，因此在后續(xù)研究中，GS NPs按此質(zhì)量比條件包裹p53質(zhì)粒，作為納米復(fù)合物。
圖4 以不同質(zhì)量比復(fù)合的GS-p53納米復(fù)合物粒徑和表面電位分析
2.4 GS-p53體外對p53基因的釋放性
圖5為GS-p53納米復(fù)合物在50、150 mmol/L和300 mmol/L NaCl溶液中體外對p53基因的釋放性。圖5顯示：120 min時(shí)，隨著NaCl濃度的增加，p53電泳帶的亮度逐漸增加，表明p53釋放量的增加。納米復(fù)合物在300 mmol/L的NaCl溶液中有明顯的p53電泳帶，且隨著振蕩時(shí)間的延長，條帶亮度增加，表明對p53的釋放作用增強(qiáng)。其原因可能是鹽溶液環(huán)境中，納米顆粒對p53的靜電作用被鹽離子競爭性破壞，因此隨著鹽濃度的增加和時(shí)間的延長，離子競爭效應(yīng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致p53釋放增大。
圖5 GS-p53對p53的釋放性
注：泳道ND為裸p53；泳道1—9分別代表GS-p53納米復(fù)合物在50 mmol/L NaCl溶液中37 ℃恒溫振蕩30、60 min和120 min(泳道1、2、3)，150 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道4、5、6)，300 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道7、8、9)。
2.5 納米明膠硅氧烷的生物相容性
為了進(jìn)一步研究納米明膠硅氧烷作為基因載體的可行性，對其生物相容性進(jìn)行檢測，圖6為GS NPs在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同處理時(shí)間對肝正常細(xì)胞L-02的細(xì)胞毒性結(jié)果。圖6顯示：GS NPs對肝細(xì)胞的毒性隨濃度的增加和處理時(shí)間的延長，細(xì)胞生長受抑制比較明顯，表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度小于0.6 mg/mL時(shí)，其細(xì)胞存活率仍達(dá)到80%以上，總體而言，所制備的GS NPs具有良好的生物相容性，具備一個(gè)基因載體所必有的生物安全性，為其后續(xù)抑癌效果研究奠定基礎(chǔ)。
圖6 GS NPs的生物相容性
2.6 GS-p53細(xì)胞內(nèi)攝取研究
為探究納米明膠硅氧烷作為基因載體攜載pDNA進(jìn)入細(xì)胞后在胞內(nèi)的攝取情況，本文通過FITC標(biāo)記GS NPs，PI標(biāo)記p53，共培養(yǎng)6 h和24 h后，對溶酶體進(jìn)行染色，激光共聚焦觀察，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)共培養(yǎng)6 h時(shí)，GS-p53熒光點(diǎn)基本與溶酶體熒光點(diǎn)重疊，表明GS NPs攜載p53進(jìn)入細(xì)胞后首先被溶酶體所吞噬。24 h后，有少量熒光點(diǎn)(見圖7中的Merge圖)單獨(dú)存在，表明隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，少部分GS NPs攜載p53開始逃逸出溶酶體的吞噬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。以上結(jié)果表明GS NPs作為基因載體進(jìn)入細(xì)胞后對溶酶體的逃逸情況存在一定的時(shí)間依懶性。
圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察GS-p53進(jìn)入Hep-3b細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)攝取情況
2.7 GS-p53對肝癌細(xì)胞的抑制效果
圖8為納米顆粒終濃度為600 μg/mL(p53終濃度為3 μg/mL)的不同處理組對肝癌細(xì)胞Hep-3b分別處理24 h和48 h的抑制效果。從圖8中可以看出GS NPs對肝癌細(xì)胞具有較好的生物相容性，其細(xì)胞存活率達(dá)到80%以上。GS NPs攜載p53后對肝癌細(xì)胞Hep-3b具有較顯著的抑制效果；相對于裸p53質(zhì)粒，GS-p53表現(xiàn)出極顯著的抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)24 h和48 h后，加入GS-p53納米復(fù)合物組細(xì)胞存活率分別為69.7%和63.3%，說明隨著處理時(shí)間的延長，肝癌細(xì)胞的存活率有所降低，在48 h時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。推測可能是隨著時(shí)間的延長，更多的GS NPs攜載p53逃逸出溶酶體的吞噬，從而進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)染的原因。
圖8 GS-p53對肝癌細(xì)胞Hep-3b的抑制效果
注：**表示p<0.01，對GS組和GS-p53組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；***表示p<0.001，對pEGFP-C1-p53組和GS-p53組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.8 Western blot檢測p53蛋白的表達(dá)水平
本文以β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白，用Western blot檢測GFP-p53融合蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖9所示，由圖9可知，內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)水平基本一致，而GFP-p53呈現(xiàn)不同的表達(dá)，說明在上樣量相同的情況下，對于肝癌細(xì)胞Hep-3b，裸p53沒有融合蛋白的表達(dá)，而在有載體GS NPs的介導(dǎo)下，Hep-3b細(xì)胞內(nèi)能成功表達(dá)融合蛋白。因此，GS NPs作為一種基因載體可成功攜載p53進(jìn)入肝癌細(xì)胞Hep-3b轉(zhuǎn)染并使GFP-p53融合蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到一定的抑制效果。
圖9 Hep-3b細(xì)胞p53蛋白表達(dá)檢測
3 結(jié) 論
本文采用溶膠-凝膠法制備納米明膠硅氧烷，探討反應(yīng)中不同pH值鹽酸溶液的影響，并對其進(jìn)行表征分析；通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測其對pDNA的負(fù)載率及釋放性；CCK-8法檢測其生物相容性；激光共聚焦觀察納米復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后在胞內(nèi)的攝取情況；MTT法和Western blot實(shí)驗(yàn)綜合評估其負(fù)載p53基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制效果。主要結(jié)論如下：
a) 采用溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中，必須是在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境下，反應(yīng)才能進(jìn)行從而合成GS NPs；隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，粒徑分布變寬，但其形貌不會產(chǎn)生較大影響，仍呈無規(guī)則球狀顆粒，分散性較好，且表面帶有一定的正電荷。GS NPs是以pH值3.0的鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)條件下獲得，其粒徑約250 nm左右、表面Zeta電位38 mV。
b) GS NPs在30∶1時(shí)可有效負(fù)載p53，但作為基因載體其在200∶1的質(zhì)量比時(shí)合成的納米復(fù)合物GS-p53粒徑較小，表面帶有一定的正電位，最適合細(xì)胞膜的胞吞作用。此外，GS NPs在鹽溶液條件下可實(shí)現(xiàn)對p53的釋放。
c) GS NPs對人正常肝細(xì)胞L-02的毒性較低，具有良好的生物相容性。攜載p53進(jìn)入細(xì)胞后少部分納米復(fù)合物可逃逸出溶酶體的吞噬，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)染使GFP-p53融合蛋白在肝癌細(xì)胞Hep-3b內(nèi)成功表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，對肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制效果。
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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)
0 引 言
原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性腫瘤，是世界上第五大常見癌癥，也是世界上癌癥死亡率較高的主要疾病之一[1]，在發(fā)展中國家，HCC發(fā)生率超過80%并在男性發(fā)病率中居第二位[2]。目前，治療肝癌有許多方法，包括手術(shù)切除、化療、局部消融和肝移植，但大多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)展成為晚期不適合手術(shù)，且這些方法也存在顯著的毒性和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。目前在大多數(shù)國家中仍缺乏有效的治療方法，HCC的死亡率幾乎等于發(fā)病率[6]。因此，開發(fā)一種在提高肝癌患者預(yù)后能力和盡量減少與治療相關(guān)的毒性的治療方法是非常迫切的。
基因治療作為一種新興的治療方法，是依賴某種載體遞送核酸如質(zhì)粒DNA、siRNA和miRNA等進(jìn)入患者細(xì)胞從而達(dá)到治療目的[7]，現(xiàn)已被廣泛認(rèn)為是治療許多疾病的有效方法，如心血管[8]、遺傳性疾病[9]、神經(jīng)性疾病[10]、惡性腫瘤[11]以及多基因誘導(dǎo)疾病如血友病[12]和肌肉萎縮癥[13]等。迄今為止，近2600個(gè)基因治療臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成并在全球獲得批準(zhǔn)[14]。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及人類基因組工程的完成，人類疾病DNA基因組學(xué)的深入研究，通過基因治療手段來治愈疾病的新模式策略也越來越為人所接受，但選擇一種高效、安全的基因載體和治療基因仍然是成功基因治療的巨大挑戰(zhàn)。
p53蛋白作為腫瘤抑制因子可參與多種細(xì)胞反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、自噬、代謝、mRNA翻譯和反饋機(jī)制等方面起著重要作用[15]。p53基因的突變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，超過50%的癌癥(包括HCC)是由p53基因突變引起的[16]。用腺病毒作為基因載體重新引入野生型p53基因已經(jīng)達(dá)到臨床水平，其中也包括對HCC的治療[17-18]。脂質(zhì)體[15]和陽離子聚合物[19]的非病毒載體也越來越多地被用于p53基因傳遞治療HCC，引入野生型p53誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而成為癌癥基因治療的一種新手段。
明膠硅氧烷納米顆粒(Gelatin siloxane nanoparticles，GS NPs)具有低毒性、可降解性、表面易吸附、易修飾性以及易重復(fù)合成等優(yōu)點(diǎn)，作為生物材料已被廣泛用于骨組織工程[20]、腦疾病治療[21-22]和基因藥物載體[23-24]等研究。由于GS NPs表面帶有較大量的正電荷，可作為一種潛在的基因載體材料，介導(dǎo)目的基因進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)，但對于GS NPs負(fù)載治療基因?qū)Π┘?xì)胞的效果卻鮮有報(bào)道。本文采用溶膠-凝膠法探究不同的pH值鹽酸溶液對納米明膠硅氧烷制備的影響及其作為基因載體負(fù)載p53基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制效果。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
a) 材料：pEGFP-C1-p53(p53)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室所保存，明膠(100 g，美國BBI公司)，GPSM(3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)、APTMS((3-氨丙基)三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)，F(xiàn)ITC(異硫氰酸熒光素，10 mg，美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒、MTT粉末、PI(碘化丙啶)粉末、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(均購自上海碧云天公司)，LysoTracker Blue DND-22、BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，p53抗體(0.1 mL，美國Novus公司)，β-actin抗體(0.1 mL，美國Affinity公司)，鼠二抗、ECL試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。
b) 儀器：場發(fā)射掃描電鏡(ZEISS-ULTRA55，日本Hitachi公司)，動(dòng)態(tài)光散射儀(LB-550 V，英國Malvern公司)，數(shù)顯控溫磁力攪拌器(78HW-3，杭州儀表電機(jī)有限公司)，凝膠成像儀(GGM/D2，GeneGenius公司)，酶標(biāo)儀(ELx 800，BioTek公司)，激光共聚焦顯微鏡(LSM710 3-channel，德國Zeiss公司)。
1.2 不同pH值條件下納米明膠硅氧烷的制備及表征
首先分別向20.0 mL的pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中加入0.15 g的明膠，40 ℃下加熱溶解，配成明膠溶液為0.75%。再向明膠溶液中分別加入0.20 g GPSM(185 μL)，于60 ℃，500 r/min的磁力恒溫?cái)嚢杵魃蠑嚢?0 min。然后向反應(yīng)體系中加入0.08 g APTMS(75 μL)，于60 ℃下繼續(xù)攪拌8～10 h。最后停止攪拌，以14000 r/min，20 ℃離心20 min，獲取白色沉淀，超聲分散水洗三遍后，以10.0 mL的ddH2O超聲波重新懸浮，即得到約4 mg/mL GS NPs懸浮液。
用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)對顆粒形貌進(jìn)行觀察，動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)分析其粒徑和表面Zeta電位。
1.3 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
選取pH值3.0鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，新鮮制備好的GS NPs重懸超聲分散，濃度為4 mg/mL，分別與pEGFP-C1-p53以10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1和200∶1的質(zhì)量比均勻混合，用ddH2O補(bǔ)齊體系，渦旋15 s，室溫孵育靜置60 min，即得到GS-p53納米復(fù)合物。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測GS-p53復(fù)合物中是否有pDNA溢出，評價(jià)納米顆粒對p53的包封效率。
1.4 納米復(fù)合物GS-p53的粒徑和表面Zeta電位分析
取新鮮制備的GS-p53納米復(fù)合物懸液，用ddH2O稀釋后加入1.2 mL至樣品池中，置于動(dòng)態(tài)光散射儀上測定其粒徑和Zeta電位。
1.5 對p53基因的釋放性
按1.3中方法制備復(fù)合物懸液(質(zhì)量比為200∶1)，分成3等份，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)后，棄上清液，分別超聲重懸于相同體積的50、150 mmol/L和300 mmol/L的NaCl溶液中，并均置于200 r/min，37 ℃的搖床中振蕩30、60 min和120 min后，每組取出等體積的復(fù)合物懸浮液離心分離，進(jìn)行凝膠電泳檢測上清液中是否有p53溢出。
1.6 納米明膠硅氧烷的生物相容性
本文采用CCK-8試劑盒檢測GS NPs對肝細(xì)胞的毒性。納米顆粒的無菌處理：將新鮮制備的GS NPs，14 000 r/min，20 ℃，離心20 min后棄上清，75%酒精超聲重懸至相同濃度，消毒30 min后，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)，用無菌水水洗三次，超聲分散到無血清培養(yǎng)基中，得到1 mg/mL的使用液，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)濃度要求稀釋。
取對數(shù)生長期的人肝正常細(xì)胞L-02以每孔100 μL，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，并放置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長良好后更換為含有不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)GS NPs的無血清培養(yǎng)基，其中每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別共培養(yǎng)24、48 h和72 h后，吸除舊培養(yǎng)液并用PBS洗兩次，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。避光加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1～2 h后，酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處的各孔吸光值(OD值)，并根據(jù)式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率：
(1)
其中：X為細(xì)胞存活率；OD2為實(shí)驗(yàn)組的OD值；OD1為對照組的OD值；OD0為Blank組的OD值。
1.7 GS-p53細(xì)胞內(nèi)攝取情況
熒光標(biāo)記的納米顆粒(FITC-GS NPs)的制備：取新鮮制備的GS NPs重懸于pH 值8.0的磷酸緩沖液中配成2～5 mg/mL的濃度。以GS NPs/FITC的比例為300∶1加入FITC溶液，避光室溫振蕩反應(yīng)1～2 h。14,000 r/min，20 ℃離心20 min后，棄上清，ddH2O超聲洗滌三次，得到FITC-GS NPs。熒光標(biāo)記的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物的制備：先將p53用PI進(jìn)行標(biāo)記，將質(zhì)粒p53與PI以1∶1比例混勻，室溫避光孵育20 min后，即得到PI-p53質(zhì)粒。然后將FITC-GS NPs與PI-p53質(zhì)粒按1.3中的方法混合后離心棄上清(質(zhì)量比為200∶1)，即得到FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物。激光共聚焦樣品制備：取1.0 mL對數(shù)生長期、5×104個(gè)/mL的Hep-3b細(xì)胞接種于35 mm玻底培養(yǎng)皿(共聚焦專用培養(yǎng)皿)中，待細(xì)胞貼壁生長良好后，PBS洗滌兩次，更換為900 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，避光加入100 μL新鮮制備、2 mg/mL的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物懸液，分別共培養(yǎng)6 h和24 h。吸去舊培養(yǎng)液，PBS清洗兩次。更換為1.0 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入50 μL 1 μmol/L LysoTracker Blue(標(biāo)記溶酶體)染色液繼續(xù)孵育2 h。去除舊培養(yǎng)基，PBS洗滌三次，每次清洗3～5 min。加入1.0 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min。去除固定液，PBS洗滌三次。于玻底滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，4 ℃黑暗環(huán)境下短時(shí)間保存。所有操作均需避光。激光共聚焦顯微鏡下觀察：綠色代表GS NPs，紅色代表p53質(zhì)粒，藍(lán)色代表溶酶體細(xì)胞器。
1.8 GS-p53對肝癌細(xì)胞的抑制效果
本文采用MTT法檢測GS-p53處理后，肝癌細(xì)胞的存活率情況。取生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞Hep-3b消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培液，加入不同處理組的無血清培養(yǎng)液：裸p53、GS NPs、GS-p53(每孔納米顆粒的終濃度為600 μg/mL，p53濃度3 μg/mL)，繼續(xù)共培養(yǎng)24、48 h后，PBS清洗兩次，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，小心吸除每孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，輕微振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率。
1.9 Western blot檢測p53蛋白表達(dá)水平
GFP-p53融合蛋白的收集：取對數(shù)生長期Hep-3b細(xì)胞以每孔2.0 mL培養(yǎng)基和2×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁良好后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，分別加入等量的p53和GS-p53(納米顆粒終濃度為1 mg/mL)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h后，棄盡舊培養(yǎng)液并用PBS清洗兩次，每孔加入100 μL RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min后收集并加入6×loading buffer于100 ℃金屬浴10 min，用于SDS-PAGE電泳或-20 ℃短期保存。
SDS-PAGE電泳：本文采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，按試劑盒操作說明配制SDS-PAGE。每孔加入50 μg蛋白樣品，Maker 5 μL，于80 V電壓下電泳至濃縮膠分離膠分界處時(shí)，加大電壓至120 V，電泳約1.5 h。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后以負(fù)膠正膜(負(fù)極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(甲醇活化20 s，正面朝下)-濾紙-海綿-正極)的順序組裝好并置入電轉(zhuǎn)槽中，加入4 ℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，于冰上轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，時(shí)間90 min。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST清洗三次，每次5 min，置于5%脫脂奶粉封閉液中，119 r/min室溫封閉2 h。抗體孵育并顯影：棄掉封閉液，加入10.0 mL一抗溶液(p53抗體以1∶1000比例稀釋，內(nèi)參β-actin以1∶3000比例稀釋)，119 r/min 4 ℃孵育過夜。TBST清洗四次，每次15 min，加入鼠二抗溶液(以1∶5000比例稀釋)，119 r/min室溫孵育2 h。TBST清洗四次后置于超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光檢測。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2.1 不同pH值條件下的GS NPs制備
為了探究溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中鹽酸溶液pH值的影響，本實(shí)驗(yàn)以不同pH值鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，分別研究pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液條件對GS NPs粒徑、表面Zeta電位和形貌的影響，結(jié)果如表1和圖1所示。表1結(jié)果顯示：pH值2.0鹽酸溶液中，反應(yīng)難以形成乳白色懸濁液即GS NPs；當(dāng)在pH值為3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中，反應(yīng)8～10 h均可得到乳白色懸濁液，因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs過程中，必須在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境中進(jìn)行，GPSM中環(huán)氧基團(tuán)才能和明膠的氨基反應(yīng)以形成明膠-GPSM化合物。隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，分散性系數(shù)由0.21增大到0.31，粒徑分布如圖1所示：pH值越小，粒徑分布越均勻，pH值3.0和4.0鹽酸條件下主要分布在200～400 nm，pH值5.0時(shí)分布較寬；Zeta電位并未因粒徑分布發(fā)生較大變化，穩(wěn)定在37～40 mV(表1)。以上結(jié)果表明，當(dāng)其他反應(yīng)條件不變時(shí)，鹽酸溶液的酸性越弱，制備的GS NPs平均粒徑越大，分布越寬，而對表面組成無較大影響，仍帶正電荷。
表1 不同pH值體系下GS NPs的粒徑、Zeta電位和分散性系數(shù)
注：pH值2.0鹽酸溶液下，未形成乳白色懸濁液即GS NPs。
圖1 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的粒徑分布
圖2為不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的場發(fā)射掃描電鏡圖。圖2(a)-(c)顯示，pH值大于2.0鹽酸環(huán)境下制備的GS NPs呈不規(guī)則的球形形貌，分散性較好，存在一種粒徑均一約50～100 nm的小顆粒。pH值越大，納米顆粒粒徑越大，鹽酸溶液pH值5.0時(shí)形成的粒徑約300 nm以上明顯比pH值3.0時(shí)大，pH值3.0和pH值4.0時(shí)形成的GS NPs粒徑較均一，約250～300 nm間，且pH值3.0下形成的較小顆粒相對于pH值4.0較多，可能導(dǎo)致pH值3.0平均粒徑相對較小。與粒徑DLS結(jié)果綜合分析，pH值3.0鹽酸溶液下制備的GS NPs分散性較好，平均粒徑較小，粒徑分布集中，表面帶有一定的正電位。
圖2 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的FE-SEM圖
2.2 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
為了定性分析GS NPs對pEGFP-C1-p53的包裹能力，對納米復(fù)合物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，隨著質(zhì)量比的逐漸增大，條帶亮度逐漸減弱，點(diǎn)樣孔的亮度逐漸增強(qiáng)，表明游離的p53逐漸減少，而在點(diǎn)樣孔中滯留的p53逐漸增多，說明納米顆粒的包裹能力隨著其含量的增加而增強(qiáng)。其中GS NPs在質(zhì)量比為30∶1時(shí)，未出現(xiàn)明顯條帶，表明GS NPs以30∶1的質(zhì)量比能很好地包裹住p53。
圖3 GS NPs對pEGFP-C1-p53的包封性檢測
注：泳道ND為裸p53；泳道1～6分別為GS NPs/p53質(zhì)量比為10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1。
2.3 GS-p53的粒徑和表面Zeta電位
對于非病毒基因載體來說，其粒徑和表面電位是影響細(xì)胞內(nèi)化效率和進(jìn)入細(xì)胞方式的重要影響因素[25]。通過對GS-p53納米復(fù)合物的粒徑和表面電位分析，分析其最適進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)量比復(fù)合，結(jié)果如圖4所示。圖4表明：GS NPs與p53復(fù)合后，表面電位呈現(xiàn)明顯的下降，其原因是納米顆粒負(fù)載p53質(zhì)粒是通過正負(fù)電荷靜電吸附作用使pDNA結(jié)合到納米顆粒表面，屏蔽納米顆粒表面的正電荷，導(dǎo)致了其表面電位的下降。GS NPs粒徑明顯呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)復(fù)合物表面電位為0左右，粒徑達(dá)到微米以上，說明復(fù)合物呈現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，此時(shí)質(zhì)量比30∶1，結(jié)合圖3中的GS NPs的包封性，推測其原因可能是當(dāng)質(zhì)量比為30∶1時(shí)，GS NPs剛好能最大比包裹住質(zhì)粒p53，從而導(dǎo)致復(fù)合物呈電中性，復(fù)合物間的同種電荷排斥力減弱，而呈現(xiàn)明顯的團(tuán)聚。由圖4還可知，隨著納米顆粒質(zhì)量比的增加，復(fù)合物表面電位大體呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，最后趨于穩(wěn)定，這表明隨著納米粒子的增多，其吸附能力越強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到一定包裹比例后，pDNA含量不會顯著影響其表面電位。而當(dāng)復(fù)合物表面電位穩(wěn)定于30 mV左右時(shí)，其粒徑仍有一定程度的增大，但總體小于400 nm，表明粒徑的增大主要是由于pDNA結(jié)合到納米顆粒表面引起的。納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞主要是由于表面正電荷與細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷分子的靜電相互作用而使其與膜結(jié)合，因此對于納米顆粒復(fù)合物來說，維持一定的正電荷是很有必要的，且在納米顆粒與p53質(zhì)量比為200∶1的條件下GS-p53具有較小的粒徑和一定的正電位，因此在后續(xù)研究中，GS NPs按此質(zhì)量比條件包裹p53質(zhì)粒，作為納米復(fù)合物。
圖4 以不同質(zhì)量比復(fù)合的GS-p53納米復(fù)合物粒徑和表面電位分析
2.4 GS-p53體外對p53基因的釋放性
圖5為GS-p53納米復(fù)合物在50、150 mmol/L和300 mmol/L NaCl溶液中體外對p53基因的釋放性。圖5顯示：120 min時(shí)，隨著NaCl濃度的增加，p53電泳帶的亮度逐漸增加，表明p53釋放量的增加。納米復(fù)合物在300 mmol/L的NaCl溶液中有明顯的p53電泳帶，且隨著振蕩時(shí)間的延長，條帶亮度增加，表明對p53的釋放作用增強(qiáng)。其原因可能是鹽溶液環(huán)境中，納米顆粒對p53的靜電作用被鹽離子競爭性破壞，因此隨著鹽濃度的增加和時(shí)間的延長，離子競爭效應(yīng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致p53釋放增大。
圖5 GS-p53對p53的釋放性
注：泳道ND為裸p53；泳道1—9分別代表GS-p53納米復(fù)合物在50 mmol/L NaCl溶液中37 ℃恒溫振蕩30、60 min和120 min(泳道1、2、3)，150 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道4、5、6)，300 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道7、8、9)。
2.5 納米明膠硅氧烷的生物相容性
為了進(jìn)一步研究納米明膠硅氧烷作為基因載體的可行性，對其生物相容性進(jìn)行檢測，圖6為GS NPs在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同處理時(shí)間對肝正常細(xì)胞L-02的細(xì)胞毒性結(jié)果。圖6顯示：GS NPs對肝細(xì)胞的毒性隨濃度的增加和處理時(shí)間的延長，細(xì)胞生長受抑制比較明顯，表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度小于0.6 mg/mL時(shí)，其細(xì)胞存活率仍達(dá)到80%以上，總體而言，所制備的GS NPs具有良好的生物相容性，具備一個(gè)基因載體所必有的生物安全性，為其后續(xù)抑癌效果研究奠定基礎(chǔ)。
圖6 GS NPs的生物相容性
2.6 GS-p53細(xì)胞內(nèi)攝取研究
為探究納米明膠硅氧烷作為基因載體攜載pDNA進(jìn)入細(xì)胞后在胞內(nèi)的攝取情況，本文通過FITC標(biāo)記GS NPs，PI標(biāo)記p53，共培養(yǎng)6 h和24 h后，對溶酶體進(jìn)行染色，激光共聚焦觀察，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)共培養(yǎng)6 h時(shí)，GS-p53熒光點(diǎn)基本與溶酶體熒光點(diǎn)重疊，表明GS NPs攜載p53進(jìn)入細(xì)胞后首先被溶酶體所吞噬。24 h后，有少量熒光點(diǎn)(見圖7中的Merge圖)單獨(dú)存在，表明隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，少部分GS NPs攜載p53開始逃逸出溶酶體的吞噬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。以上結(jié)果表明GS NPs作為基因載體進(jìn)入細(xì)胞后對溶酶體的逃逸情況存在一定的時(shí)間依懶性。
圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察GS-p53進(jìn)入Hep-3b細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)攝取情況
2.7 GS-p53對肝癌細(xì)胞的抑制效果
圖8為納米顆粒終濃度為600 μg/mL(p53終濃度為3 μg/mL)的不同處理組對肝癌細(xì)胞Hep-3b分別處理24 h和48 h的抑制效果。從圖8中可以看出GS NPs對肝癌細(xì)胞具有較好的生物相容性，其細(xì)胞存活率達(dá)到80%以上。GS NPs攜載p53后對肝癌細(xì)胞Hep-3b具有較顯著的抑制效果；相對于裸p53質(zhì)粒，GS-p53表現(xiàn)出極顯著的抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)24 h和48 h后，加入GS-p53納米復(fù)合物組細(xì)胞存活率分別為69.7%和63.3%，說明隨著處理時(shí)間的延長，肝癌細(xì)胞的存活率有所降低，在48 h時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。推測可能是隨著時(shí)間的延長，更多的GS NPs攜載p53逃逸出溶酶體的吞噬，從而進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)染的原因。
圖8 GS-p53對肝癌細(xì)胞Hep-3b的抑制效果
注：**表示p<0.01，對GS組和GS-p53組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；***表示p<0.001，對pEGFP-C1-p53組和GS-p53組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.8 Western blot檢測p53蛋白的表達(dá)水平
本文以β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白，用Western blot檢測GFP-p53融合蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖9所示，由圖9可知，內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)水平基本一致，而GFP-p53呈現(xiàn)不同的表達(dá)，說明在上樣量相同的情況下，對于肝癌細(xì)胞Hep-3b，裸p53沒有融合蛋白的表達(dá)，而在有載體GS NPs的介導(dǎo)下，Hep-3b細(xì)胞內(nèi)能成功表達(dá)融合蛋白。因此，GS NPs作為一種基因載體可成功攜載p53進(jìn)入肝癌細(xì)胞Hep-3b轉(zhuǎn)染并使GFP-p53融合蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到一定的抑制效果。
圖9 Hep-3b細(xì)胞p53蛋白表達(dá)檢測
3 結(jié) 論
本文采用溶膠-凝膠法制備納米明膠硅氧烷，探討反應(yīng)中不同pH值鹽酸溶液的影響，并對其進(jìn)行表征分析；通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測其對pDNA的負(fù)載率及釋放性；CCK-8法檢測其生物相容性；激光共聚焦觀察納米復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后在胞內(nèi)的攝取情況；MTT法和Western blot實(shí)驗(yàn)綜合評估其負(fù)載p53基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制效果。主要結(jié)論如下：
a) 采用溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中，必須是在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境下，反應(yīng)才能進(jìn)行從而合成GS NPs；隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，粒徑分布變寬，但其形貌不會產(chǎn)生較大影響，仍呈無規(guī)則球狀顆粒，分散性較好，且表面帶有一定的正電荷。GS NPs是以pH值3.0的鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)條件下獲得，其粒徑約250 nm左右、表面Zeta電位38 mV。
b) GS NPs在30∶1時(shí)可有效負(fù)載p53，但作為基因載體其在200∶1的質(zhì)量比時(shí)合成的納米復(fù)合物GS-p53粒徑較小，表面帶有一定的正電位，最適合細(xì)胞膜的胞吞作用。此外，GS NPs在鹽溶液條件下可實(shí)現(xiàn)對p53的釋放。
c) GS NPs對人正常肝細(xì)胞L-02的毒性較低，具有良好的生物相容性。攜載p53進(jìn)入細(xì)胞后少部分納米復(fù)合物可逃逸出溶酶體的吞噬，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)染使GFP-p53融合蛋白在肝癌細(xì)胞Hep-3b內(nèi)成功表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，對肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制效果。
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