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(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

0 引 言

樺褐孔菌[Inontusobliquus(Fr.) Pilat]是一種藥用真菌，屬于白腐真菌，廣泛分布在北美、歐洲和亞洲的北緯45°～50°地區(qū)[1]。在俄羅斯和西伯利亞西部，該真菌主要生長(zhǎng)在樺樹(shù)的樹(shù)干上，能夠引起木材的白化腐朽，被稱(chēng)作是白腐真菌[1-3]。樺褐孔菌用于民間醫(yī)學(xué)達(dá)四個(gè)多世紀(jì)，用來(lái)預(yù)防和治療心、肝、胃的疾病以及各種疑難雜癥[4-5]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于實(shí)驗(yàn)研究的樺褐孔菌子實(shí)體購(gòu)于杭州市胡慶余堂。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、沒(méi)食子酸、蘆丁和福林酚等實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)于杭州米克試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌子實(shí)體多酚的提取

將樺褐孔菌子實(shí)體用烘箱烘干至恒重，用研缽將其顆粒充分研碎，取1.0 g將其盛入離心管中，加入7.0 mL體積的甲醇溶劑，并利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)來(lái)進(jìn)行破壁提取，將破碎后的勻漿液在恒溫水浴鍋中60 ℃下靜置6 h，萃取3次，通過(guò)高速離心機(jī)離心得到含有多酚的上清液；將所得的上清液旋干，加入去離子水得到水溶液，先采用有機(jī)溶劑氯仿來(lái)進(jìn)行萃取，之后再依次用乙酸乙酯和正丁醇對(duì)水層進(jìn)行萃取，最后將萃取得到的乙酸乙酯層和正丁醇層萃取液真空旋干，獲得樺褐孔菌子實(shí)體的乙酸乙酯層多酚和正丁醇層多酚。

1.2.2 子實(shí)體多酚的柱色譜分離

稱(chēng)取25.0 g葡聚糖凝膠Sephadex LH-20干粉粉末，并溶解于蒸餾水中，間隔30 min就攪拌一次使其溶脹，充分過(guò)夜溶脹之后將其填充在柱色譜玻璃柱中，蒸餾水沖洗2～3個(gè)柱體積使柱子壓實(shí)。濕法上樣后，通過(guò)不同比例的甲醇水溶液按照極性由大到小的順序以1滴/s的速度洗脫，每個(gè)試管接5.0 mL洗脫液，并且按順序?qū)⒃嚬軜?biāo)號(hào)。在280 nm波長(zhǎng)下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)試管中洗脫液的吸光度值，根據(jù)測(cè)得的每個(gè)小試管中洗脫液的吸光度值，繪制吸光度值與小試管編號(hào)的變化曲線。根據(jù)曲線，將同一個(gè)峰的小試管洗脫液合并成一個(gè)組分，將每一個(gè)組分旋干后定容到10.0 mL，分析每一個(gè)組分的多酚、黃酮含量及抗氧化活性具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

1.2.3 子實(shí)體多酚、黃酮含量的測(cè)定

a) 多酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法來(lái)測(cè)定各個(gè)組分的多酚含量，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。將經(jīng)過(guò)提取純化后的樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分定容到10.0 mL，用福林-酚法測(cè)定波長(zhǎng)為765 nm下的OD值，根據(jù)福林-酚法測(cè)得的多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)組分多酚的含量。

b) 黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定采用氯化鋁顯色法，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。將經(jīng)過(guò)提取純化后的樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分定容到10.0 mL，吸取1.0 mL，加入2.0 mL濃度為0.1 mol/L 氯化鋁試劑，加入3.0 mL 濃度為1.0 mol/L 的醋酸鈉試劑，以溶劑(V乙醇∶V水=3∶2)將體積補(bǔ)至10.0 mL，搖勻。在420 nm處測(cè)OD值。根據(jù)黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出每個(gè)組分的黃酮含量。

1.2.4 子實(shí)體多酚DPPH的IC50值的測(cè)定

首先配置(0.4 mmol/L)的DPPH甲醇溶液，然后在10.0 mL試管中加入0.8 mL DPPH甲醇溶液，在加入2.4 mL的多酚樣品，將兩者充分混合后放置在暗室中，在室溫下保持30 min。在波長(zhǎng)為517 nm下，測(cè)得A1值,具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。將多酚樣品換成蒸餾水作為對(duì)照組，在相同的波長(zhǎng)下測(cè)得A0值。將DPPH甲醇溶液換成甲醇溶液，其它條件與前面相同，在同樣的波長(zhǎng)下測(cè)其A2值。DPPH自由基清除率X計(jì)算公式如下：

式中：A0為0.8 mL DPPH甲醇和2.4 mL蒸餾水混合溶液的吸光度；A1為 0.8 mL DPPH甲醇和2.4 mL多酚混合樣品的吸光度；A2為 0.8 mL甲醇和2.4 mL多酚混合樣品的吸光度。

將樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分離的每一個(gè)組分分別測(cè)量五個(gè)濃度梯度(2.0～10.0 mg)，求得每一個(gè)組分的DPPH的IC50值，并經(jīng)過(guò)SPSS軟件分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)算出樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層和正丁醇層不同組分多酚的IC50值。

1.2.5 子實(shí)體多酚TEAC法抗氧化活性的測(cè)定

TEAC抗氧化活性實(shí)驗(yàn)是參考參考文獻(xiàn)[19]，具體方法為：將5.0 mL的7.0 mmol/L ABTS(2,2-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽))和88 μL的140.0 mmol/L過(guò)硫酸鉀混勻,在避光條件下將其置于恒溫水浴鍋中，在30 ℃下靜置過(guò)夜，獲得ABTS·+儲(chǔ)備液。配制20.0 mmol/L pH值為4.5的醋酸鈉緩沖液，通過(guò)醋酸鈉緩沖液將ABTS·+儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋?zhuān)钡綄?chǔ)備液稀釋到在734 nm波長(zhǎng)下的吸光度在0.70±0.02這個(gè)范圍里時(shí)為止，ABTS·+工作液。吸取柱色譜分段組分30.0 μL和3.0 mL的ABTS·+工作液充分混合10 s，將其在30 ℃水浴下靜置6 min，以醋酸鈉緩沖液作為對(duì)照，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。采用同樣的方法測(cè)定Trolox不同濃度下吸光度值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分都稀釋成五個(gè)不同的濃度(與DPPH實(shí)驗(yàn)濃度梯度相同)，在各個(gè)多酚濃度下按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到每一個(gè)組分不同多酚濃度下的吸光值，繪制每一個(gè)組分多酚濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)TEAC法Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每一個(gè)組分的TEAC值。

1.2.6 子實(shí)體多酚FRAP法抗氧化活性的測(cè)定

鐵還原/總抗氧化能力測(cè)定(FRAP法)按照參考文獻(xiàn)[19]。首先制備20.0 mmol/L三氯化鐵溶液、10.0 mmol/L三吡啶基三嗪(TPTZ)鹽酸溶液和300.0 mmol/L pH值為3.6的醋酸鹽緩沖液。吸取上述制備好的三氯化鐵溶液和三吡啶基三嗪(TPTZ)鹽酸溶液各2.5 mL與25.0 mL醋酸鹽緩沖液充分混合，然后再取該混合溶液1.8 mL，在37 ℃水浴條件下，分別加入180.0 μL蒸餾水和60.0 μL柱色譜分段提取液，待其反應(yīng)30 min后，以60.0 μL的甲醇作為對(duì)照，在593 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量其紫外吸光值。采用同樣的方法測(cè)定Trolox不同濃度下吸光度值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取液抗氧化活性結(jié)果表示成FRAP值的形式，即每克多酚的含量相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的摩爾數(shù)。將子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分都稀釋成五個(gè)不同的濃度(與DPPH實(shí)驗(yàn)濃度梯度相同)，在各個(gè)多酚濃度下按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到每一個(gè)組分不同多酚濃度下的吸光值，進(jìn)而建立每一個(gè)組分多酚濃度與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所建立的FRAP法Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每一個(gè)組分的FRAP值。

2 結(jié)果與討論

2.1 子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜流出曲線分析

用葡聚糖凝膠柱色譜分離的方法，不同比例的水和甲醇為洗脫劑對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層組分進(jìn)行分離，根據(jù)洗脫液在280 nm下吸光度不同，將洗脫物合并為不同的分段組分，所制得乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜流出曲線如圖1所示。樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層根據(jù)流出曲線均是獲得5個(gè)組分，由于乙酸乙酯層多酚和正丁醇層多酚的極性不同，所以柱色譜流出曲線也是不同的，在乙酸乙酯層多酚柱色譜分段組分中SF3中有著最高的吸光度，而在正丁醇層多酚柱色譜分段組分中SF1有著最高的吸光度。

圖1 樺褐孔菌子實(shí)體中的多酚柱色譜流出曲線

注：SF1～SF5是指柱色譜分離的第一到第五組分

2.2 子實(shí)體萃取物柱色譜分段組分多酚和黃酮含量

采用葡聚糖凝膠柱色譜分離的方法，不同比例的水和甲醇為洗脫劑對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層組分進(jìn)行分離，根據(jù)洗脫液在280 nm下吸光度不同，將洗脫物合并為不同的分段組分，測(cè)定得到的樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分的多酚和黃酮含量如圖2和圖3所示。由圖2可以得知，乙酸乙酯層分段洗脫物組分中SF3部分的多酚、黃酮含量明顯高于其他組分，分別達(dá)到163.71 mg和65.82 mg，多酚含量的由高到低依次為163.71 mg(SF3)、136.42 mg(SF1)、54.13 mg(SF5)、43.22 mg(SF2)、21.94 mg(SF4)，而黃酮含量由高到低為65.82 mg(SF3)、42.16 mg(SF2)、30.83 mg(SF1)、20.93 mg(SF4)、12.39 mg(SF5)。樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層柱色譜分段組分多酚、黃酮含量由高到低的順序呈現(xiàn)不一致性，其可能是因?yàn)榉铀岬母蓴_，因?yàn)榉铀崾切》肿拥亩喾?，它的存在?huì)使得多酚含量的增加，卻不會(huì)使得黃酮含量的增加，因此使得乙酸乙酯層柱色譜分段組分的的多酚、黃酮含量在高低順序上表現(xiàn)出了不一致性，與Kaewseejan等[15]所報(bào)道結(jié)果相一致。

圖2 子實(shí)體乙酸乙酯層柱色譜分段組分多酚和黃酮含量

樺褐孔菌子實(shí)體正丁醇層柱色譜分段洗脫物組分的多酚和黃酮含量如圖3所示，結(jié)果顯示：多酚的含量為74.21～261.06 mg，按多酚含量高低的順序?yàn)?61.06 mg(SF2)、231.38 mg(SF4)、139.64 mg(SF5)、103.02 mg(SF3)、74.21 mg(SF1)，其中SF2和SF4這兩個(gè)組分的多酚含量是比較接近的，SF2(261.06 mg)要略高于SF4(231.38 mg)，其它三個(gè)組分的多酚含量與這兩個(gè)組分相比差距較大，要明顯少于這兩個(gè)組分。黃酮含量的范圍是34.13～85.12 mg，其黃酮含量的高低順序?yàn)?5.12 mg(SF3)、56.33 mg(SF1)、51.63 mg(SF4)、48.73 mg(SF2)、34.13 mg(SF5)。與多酚含量相比，從圖3中可以看出，這五個(gè)組分的黃酮含量并沒(méi)有表現(xiàn)出很大的差異性。而且多酚含量和黃酮含量的高低順序也沒(méi)有表現(xiàn)出一致性。在這五個(gè)組分當(dāng)中，黃酮占多酚比重的最大是SF3，占比為82.6%；而占比最小的是SF2，為18.7%。

圖3 子實(shí)體正丁醇層柱色譜分段組分多酚和黃酮含量

2.3 子實(shí)體萃取物柱色譜分段組分的抗氧化活性

樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分多酚的抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明：乙酸乙酯層柱色譜分段組分的DPPHIC50值由低到高的順序依次為17.88 μg/mL(SF3)、20.67 μg/mL(SF2)、24.72 μg/mL(SF1)、26.23 μg/mL(SF4)、33.91 μg/mL(SF5)。DPPH的IC50值越小，表示其清除DPPH·能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)[18]。

對(duì)于TEAC法，其結(jié)果表示成TEAC值的形式，即每克多酚的含量相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的摩爾數(shù)。TEAC法實(shí)際上測(cè)定的是多酚樣品對(duì)于ABTS·+的清除能力[20]。TEAC值越大，那么表示該組分的每1.0 g多酚樣品的抗氧化活性相當(dāng)于Trolox的摩爾數(shù)越大，繼而表示該組分多酚的抗氧化活性越強(qiáng)。由表1可知樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層柱色譜分段五個(gè)組分TEAC值由大到小的順序?yàn)?.32 mmol(SF3)、2.72 mmol(SF2)、2.25 mmol(SF1)、1.96 mmol(SF4)、1.86 mmol(SF5)，以上結(jié)果表明：樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層柱色譜分段五個(gè)組分的TEAC法抗氧化活性的大小順序與DPPH抗氧化活性的結(jié)果相一致。對(duì)于FRAP法，其結(jié)果表示成FRAP值的形式，即每克多酚的含量相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的摩爾數(shù)。那么FRAP值越大代表該組分多酚的抗氧化活性越強(qiáng)[20]。表1顯示樺褐孔菌子實(shí)體乙酸乙酯層柱色譜分段五個(gè)組分的FRAP法抗氧化活性的大小順序依次為3.12 mmol(SF3)、2.36 mmol(SF2)、1.89 mmol(SF1)、1.37 mmol(SF4)、1.16 mmol(SF5)，與DPPH和TEAC法抗氧化活性的順序完全一致，說(shuō)明這三種抗氧化活性的結(jié)果保持高度的一致性。樺褐孔菌子實(shí)體正丁醇層柱色譜分段組分多酚的三種抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果也呈現(xiàn)出一致性，其中SF3組分具有最強(qiáng)的抗氧化活性，其DPPH IC50值、TEAC值、FRAP值分別為15.00 μg/mL，4.33 mmol/g和3.36 mmol/g。樺褐孔菌子實(shí)體正丁醇層柱色譜分段五個(gè)組分DPPH抗氧化活性的強(qiáng)弱順序依次為15.00 μg/mL(SF3)、17.30 μg/mL(SF1)、20.97 μg/mL(SF2)、23.59 μg/mL(SF4)、27.87 μg/mL(SF5)。樺褐孔菌子實(shí)體正丁醇層柱色譜分段五個(gè)組分的TEAC法和FRAP法的抗氧化活性強(qiáng)弱順序與DPPH法是一致的，這與乙酸乙酯層相同。與乙酸乙酯層相比，子實(shí)體正丁醇層表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗氧化活性。正丁醇層柱色譜分段的最強(qiáng)抗氧化活性組分SF3相比于乙酸乙酯層柱色譜分段的最強(qiáng)抗氧化活性組分SF3表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗氧化活性。其TEAC值和FRAP值與Du等[20]做得植物多酚的結(jié)果相比更高，抗氧化活性更強(qiáng)。樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層的最強(qiáng)抗氧化活性組分DPPH IC50值分別為17.88 μg/mL和15.00 μg/mL，均低于Kaewseejan等[15]等對(duì)植物多酚的研究結(jié)果，因此樺褐孔菌子實(shí)體多酚進(jìn)行分離純化后具有很強(qiáng)的抗氧化活性。

表1 子實(shí)體多酚柱色譜分段組分的抗氧化活性

注：表中不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)。

2.4 抗氧化活性與黃酮含量的相關(guān)性分析

DPPH、TEAC和FRAP三種抗氧化活性與黃酮含量相關(guān)性分析的結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明：DPPH抗氧化活性相關(guān)性與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)為0.909，F(xiàn)RAP法抗氧化活性的相關(guān)性系數(shù)為0.957，TEAC法抗氧化活性的系數(shù)為0.822，因此黃酮是抗氧化活性的主導(dǎo)物質(zhì)。黃酮是優(yōu)質(zhì)的抗氧化劑，作為氫和電子的供體來(lái)說(shuō)具有很高的反應(yīng)活性[21]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)DPPH、TEAC和FRAP三種抗氧化活性之間也顯示很強(qiáng)的相關(guān)性，r值均高于0.873。因此黃酮作為一種抗氧化劑，對(duì)抗氧化活性起著非常重要的作用。

表2 黃酮含量和抗氧化活性的相關(guān)性分析

注：DPPHIC50: DPPH·清除活性;TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity, ABTS·+清除活性; FRAP: Ferric ion reducing antioxidant power,鐵離子還原能力。

3 結(jié) 論

樺褐孔菌子實(shí)體含有大量的生物活性成分，在這些生物活性成分中多酚有著很強(qiáng)的抗氧化活性，本文采用有機(jī)溶劑提取和柱色譜分離純化的方法對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體多酚進(jìn)行研究，主要結(jié)論如下：

a) 樺褐孔菌子實(shí)體多酚乙酸乙酯層和正丁醇層柱色譜分段組分中都是SF3表現(xiàn)出最高的抗氧化活性，其中正丁醇層的SF3的抗氧化活性要高于乙酸乙酯層的SF3。

b) 子實(shí)體多酚柱色譜分段組分的DPPH、TEAC和FRAP三種抗氧化活性在強(qiáng)弱上呈現(xiàn)一致性，相關(guān)性系數(shù)都達(dá)到0.873。

c) 黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性系數(shù)也達(dá)到了0.822，黃酮在子實(shí)體多酚的抗氧化活性中起重要作用。

本文基于葡聚糖凝膠Sephadex LH-20對(duì)子實(shí)體多酚的初步分離為進(jìn)一步地研究樺褐孔菌中多酚組分的鑒定奠定基礎(chǔ)。