吉楊丹，羅紅陽，王 丹，王 恒，楊小燕，何志旭，劉金河，汪顯耀，趙 錦，張麗娟，張玲敏，秦 臻，許鍵煒，

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有自我復(fù)制和多向分化潛能，可用于多種損傷性疾病的組織重建與修復(fù)[1]。臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能靶向受損的肝組織，對急慢性肝損傷均有修復(fù)作用，但療效并不穩(wěn)定，個體差異非常大。究其原因，可能與MSCs的遷移歸巢和分化以及局部微環(huán)境的影響有著密切的關(guān)系[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)能趨化MSCs向病灶部位遷移。同時微小RNA (microRNA，miRNA)參與了細(xì)胞的遷移、增殖、分化[4]，在生命活動中起重要作用。課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)miR-26b和Wnt/β-catenin信號通路參與了 MSCs干性的維持以及趨化遷移的調(diào)控。該實驗以miR-26b作為研究靶點(diǎn)，初步探討其對Wnt/β-catenin信號通路以及成肝樣不同分化狀態(tài)MSCs向HGF趨化遷移的影響，為MSCs作為種子細(xì)胞定向遷移治療肝損傷及相關(guān)機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料SD大鼠[貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格號SYXK(黔)2018-0001]，L-DMEM培養(yǎng)基、l0%FBS及0.25%EDTA(美國Hyclone公司)，HGF、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國Sigma公司)，相差顯微鏡(德國Leica公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，超凈工作臺(蘇州蘇凈集團(tuán))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Model311)、SYBR Green RT-qPCR 試劑盒(美國Thermofisher公司)，臺式高速冷凍離心機(jī)(Allegra 64R，美國貝克曼庫爾特公司)，qRT-PCR儀(StepOne，美國ABI公司)，U-LH100L-3活細(xì)胞工作站(日本OLYMPUS公司)，TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑(美國Ambion公司)，miR-26b引物(廣州銳博生物科技公司)，Q-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠MSCs的培養(yǎng)、鑒定 取5～8周齡、體質(zhì)量(150±20) g SD大鼠，乙醚麻醉處死后取兩側(cè)股骨，剪去股骨兩端，用注射器吸取L-DMEM混合液從骨髓腔反復(fù)沖出骨髓至無菌平皿中。接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含有10%FBS的L-DMEM液，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)，3～4 d換液1次。細(xì)胞生長鋪展至瓶底約80%～90%后0.25%EDTA消化傳代。培養(yǎng)至第4代，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞膜表面分子CD71、CD29、CD45和CD34的表達(dá)。

1.2.2miR-26b對Wnt/β-catenin信號通路的影響 選用生長至80%左右匯合的第四代MSCs，通過感染重組腺病毒(Ad-26b)高表達(dá)miR-26b，亂序的空病毒(Ad)為對照(由課題組前期包裝重組腺病毒獲得)[5]，PBS洗2次，按濃度為107pfu/ml的病毒液，每個培養(yǎng)皿中加入100 μl，37 ℃孵育1.5～2 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)。選取表達(dá)強(qiáng)且感染效率高的MSCs，PBS清洗2次，加入液氮，以200 μl細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并按說明書進(jìn)行操作。Western blot檢測activated β-catenin(ABC)、β-catenin、p-β-catenin(S33/S37/T41)蛋白表達(dá)的變化。將上述細(xì)胞用PBS液清洗3次。TRIzol RNA，參照試劑盒說明書，去除基因組DNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，qRT-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-Myc，RUNX2轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.2.3miR-26b對MSCs黏著斑(focal adhension,FA)、細(xì)胞骨架及形態(tài)的影響 選取上述表達(dá)強(qiáng)且感染效率高的MSCs，消化重懸，將細(xì)胞稀釋成1×104/ml的細(xì)胞懸液，接種至多聚賴氨酸(polylysine，PLL)包被的玻片上，樁蛋白(Paxillin)免疫熒光染色觀察FA，細(xì)胞鋪展面積和極性指數(shù)(長軸和短軸之比)。

1.2.4成肝樣不同分化狀態(tài)MSCs的制備及miR-26b在不同狀態(tài)MSCs中的表達(dá) 根據(jù)MSCs成肝樣細(xì)胞分化狀態(tài)，將分化過程分為A、B、C、D 4個時間點(diǎn)。未分化的細(xì)胞狀態(tài)設(shè)為A點(diǎn)，加入HGF、EGF、bFGF(加入量均為10 μl/L)與MSCs建立誘導(dǎo)共培養(yǎng)體系，加入誘導(dǎo)劑第7天(設(shè)為B點(diǎn))，第14天(設(shè)為C點(diǎn))，第21天(設(shè)為D點(diǎn))分別得到4種處于不同分化狀態(tài)(A、B、C、D) 的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。qRT-PCR檢測不同狀態(tài)MSCs中miR-26b的相對表達(dá)量。見表1。

表1 各基因RT-qPCR引物一覽表

1.2.5miR-26b對不同分化狀態(tài)的MSCs趨化遷移的影響 選用生長匯合至80%左右的第4代MSCs，通過感染重組腺病毒(Ad-26b)高表達(dá)miR-26b，空病毒(Ad)為對照(方法同1.2.2)。選取表達(dá)強(qiáng)且感染效率高的細(xì)胞用于誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞遷移實驗。誘導(dǎo)分化方法同1.2.4。

1.2.5.1Transwell趨化遷移實驗 取不同分化狀態(tài)各組細(xì)胞，制備成2×105/ml的細(xì)胞懸液，將8.0 μm孔徑的Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板，在上室加入細(xì)胞懸液200 μl/孔，同時在下室加入500 μl含HGF(25 ng/ml)L-DMEM，于37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱孵育6 h，對下室細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫浸泡染色30 min，PBS漂洗3次后顯微鏡下拍照，計算遷移至室膜下方的細(xì)胞總數(shù)。將對照組的遷移細(xì)胞數(shù)作為基數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)化定義為1。

1.2.5.2Dunn chamber遷移實驗 將上述不同分化狀態(tài)的細(xì)胞按1×104/ml的濃度接種在含PLL包被蓋玻片的培養(yǎng)皿中，在Dunn chamber內(nèi)槽加滿分化培養(yǎng)基，取長有細(xì)胞的蓋玻片細(xì)胞面朝下，放置在槽的正上方，一側(cè)僅蓋住橋不蓋住外槽，另外3側(cè)用凡士林封片，外槽加入含HGF(25 ng/ml)的L-DMEM液，凡士林封口。外槽內(nèi)的趨化因子在張力的作用下緩慢滲入內(nèi)槽，在內(nèi)外槽之間形成濃度梯度。Dunn chamber置于活細(xì)胞工作站顯微實時攝影系統(tǒng)，每5 min拍照1次，連續(xù)拍攝6 h。隨機(jī)選擇30個未與其他細(xì)胞產(chǎn)生牽拉的細(xì)胞，Cellsens軟件分析細(xì)胞遷移的軌跡，統(tǒng)計遷移距離，計算遷移速率(μm/min)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓可分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSCs顯微鏡下可見原代培養(yǎng)的細(xì)胞在4～6 h開始貼壁，5 d后呈集落生長并迅速增多，傳至第3代后，大部分細(xì)胞呈長梭形，流水、漩渦狀生長。見圖1。課題組前期用同樣方法培養(yǎng)的細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示大鼠MSCs: CD71、CD29呈陽性表達(dá)，而CD45和CD34呈陰性。

圖1 第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ×100

2.2 miR-26b參與對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控取上述重組腺病毒感染48 h后高表達(dá)miR-26b的MSCs，在綠色熒光顯微鏡下可觀察到約70%左右的MSCs發(fā)綠色熒光。qRT-PCR檢測Ad-26b組miR-26b的表達(dá)量較空病毒對照組上調(diào)，可用于后續(xù)實驗。感染48 h后提取總RNA，qRT-PCR檢測MSCs中miR-26b的相對表達(dá)量。使用U6為內(nèi)參基因，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法統(tǒng)計分析。將感染Ad后細(xì)胞中miR-26b的相對表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1。見圖2。Western blot檢測β-catenin、p-β-catenin(S33/S37/T41)、activated β-catenin(ABC)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示高表達(dá)miR-26b后ABC蛋白水平升高，p-β-catenin的蛋白水平下降，β-catenin總蛋白無變化。Wnt/β-catenin信號下游靶基因c-Myc，Runx2的表達(dá)升高。見圖3。

2.3 miR-26b上調(diào)MSCs細(xì)小FA數(shù)量、重組細(xì)胞骨架、縮小鋪展面積項目組通過重組腺病毒感染MSCs以高表達(dá)miR-26b，然后進(jìn)行Paxillin免疫熒光染色以指示FA。統(tǒng)計顯示，每百個FA中小于25 μm的FA， Ad-26b組為(57.5±6.5)個，Ad組為(38.2±3.8)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.63，P<0.05)。細(xì)胞高表達(dá)miR-26b后，細(xì)小FA數(shù)目增多，細(xì)小FA向細(xì)胞的前端周邊分布。說明miR-26b影響FA的大小及分布。見圖4。

miR-26不僅參與了細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞遷移等活動，還參與細(xì)胞形態(tài)改變。通過Cellsens軟件分析MSCs的極性指數(shù)(長軸和短軸之比)、鋪展面積。結(jié)果顯示，細(xì)胞相對面積，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=61.01，P<0.05)；極性指數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=64.41，P<0.05)。如圖5所示，高表達(dá)miR-26b后細(xì)胞面積變小，同時極性指數(shù)增大。實驗結(jié)果表明高表達(dá)miR-26b促使MSCs鋪展面積變小并且細(xì)胞呈現(xiàn)極性分布。

圖2 重組腺病毒感染MSCs 48 h后GFP及miR-26b的表達(dá)情況 ×400

圖3 miR-26b對β-catenin、p-β-catenin(S33/S37/T41)、activated β-catenin蛋白及Wnt/β-catenin下游靶基因c-Myc、Runx2的影響

2.4 miR-26b在不同分化狀態(tài) MSCs中差異性表達(dá)在誘導(dǎo)分化7 d(B點(diǎn))左右，MSCs逐漸失去其原有長梭形形態(tài)，向中心收縮、變短、變圓，誘導(dǎo)至14 d(C 點(diǎn))左右，呈現(xiàn)多邊形或立方體形、核仁橢圓的肝細(xì)胞樣形態(tài)。誘導(dǎo)分化至21 d，細(xì)胞形態(tài)一致，立體感更強(qiáng)，邊界清晰，更為典型。免疫組化檢測，隨著分化時間的增加，細(xì)胞甲胎蛋白和角質(zhì)蛋白19逐漸呈陽性表達(dá)。見圖6。qRT-PCR檢測誘導(dǎo)分化至7 d(B點(diǎn))以后，細(xì)胞miR-26b表達(dá)開始增高，B、C、D點(diǎn)較分化前(A點(diǎn))差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

2.5 miR-26b促進(jìn)不同分化狀態(tài)MSCs趨化遷移經(jīng)過6 h Transwell趨化遷移實驗，在顯微鏡100倍視野觀察遷移至小室下側(cè)的細(xì)胞數(shù)。分化至7 d的MSCs趨化遷移能力最強(qiáng)，較0、14、21 d組有差異；相同分化時間點(diǎn)，miR-26b組較Ad組遷移能力更強(qiáng)。見表2、圖8。

經(jīng)過6 h Dunn chamber遷移實驗，分化至7 d(B點(diǎn))組的MSCs平均遷移速率最高，較0、14、21 d組有差異；相同分化時間點(diǎn)，miR-26b組較Ad組遷移速率更高。見表3。

3 討論

本實驗探索了SD大鼠骨髓來源的MSCs在成肝樣分化過程中，不同分化階段以及在高表達(dá)miR-26b狀態(tài)下的趨化遷移特點(diǎn)。MSCs由于具有多向分化潛能，近年來MSCs移植治療給包括急慢性肝損傷和終末期肝病在內(nèi)的許多疑難疾病患者帶來了新的希望。骨髓來源的MSCs因其具有容易獲得，易于擴(kuò)增，體外多代次傳代培養(yǎng)生物學(xué)特性穩(wěn)定等特點(diǎn)[6]，加之如果用于自身，不用擔(dān)心外源性病毒或腫瘤等的污染，更適合自體移植[7]。肝損傷后的自我修復(fù)過程中，包括HGF在內(nèi)的許多炎癥因子表達(dá)增高。本研究顯示HGF能促進(jìn)MSCs向病變部位的遷移，并促進(jìn)其分化，這與Valente et al[8]和Shams et al[9]的研究結(jié)果一致。細(xì)胞移植中MSCs歸巢的數(shù)量與其遷移的能力密切相關(guān)，而歸巢的MSCs數(shù)量又與療效呈正比[10]。體內(nèi)實驗研究證實只有少量MSCs遷移到了病變或損傷部位，療效非常有限。因此，提高 MSCs的分化和定向遷移能力，增加定植到損傷或病變部位的移植細(xì)胞數(shù)量，更好地發(fā)揮其獨(dú)特的生物學(xué)優(yōu)勢，對改善療效至關(guān)重要。

圖4 miR-26b對MSCs FA大小的影響 ×1 000

表2 miR-26b對不同分化狀態(tài)MSCs趨化遷移的影響

圖5 miR-26b對MSCs鋪展面積、極性指數(shù)的影響 ×1 000與Ad組比較:*P<0.05

圖6 MSCs成肝樣誘導(dǎo)分化不同分化狀態(tài)細(xì)胞形態(tài)及甲胎蛋白和角質(zhì)蛋白19的表達(dá) ×200

圖7 MSCs成肝樣誘導(dǎo)分化不同分化狀態(tài)miR-26b的表達(dá)

表3 miR-26b對不同分化狀態(tài)MSCs遷移速率的影響

圖8 miR-26b對不同分化狀態(tài)MSCs趨化遷移的影響 ×100

Wnt/β-catenin信號通路與MSCs的遷移密切相關(guān)。文獻(xiàn)[11]報道，β-catenin入核是Wnt/β-catenin信號活化的重要標(biāo)志。本研究顯示miR-26b高表達(dá)后可激活β-catenin (ABC)，促進(jìn)其表達(dá)，并抑制Ser33/37/Thr41位點(diǎn)磷酸化的β-catenin的表達(dá)，從而使β-catenin的降解受到抑制，說明在MSCs中高表達(dá)miR-26b可激活Wnt/β-catenin 信號。Wnt/β-catenin信號通路激活后，β-catenin入核并結(jié)合TCF/LEF實現(xiàn)對下游靶基因的調(diào)控，從而影響各種生命活動。RT-qPCR結(jié)果顯示高表達(dá)miR-26b促進(jìn)了c-Myc和Runx2的表達(dá)。所有這些結(jié)果都表明在MSCs中高表達(dá)miR-26b確實能夠激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)MSCs趨化遷移。

項目組還采用了成肝樣分化不同階段的MSCs作為研究對象，顯示在不同分化階段，miR-26b的表達(dá)量不盡相同。在前期的研究中，用基因芯片篩選出十幾個差異表達(dá)的miRNAs，其中包括表達(dá)上調(diào)的miR-26b。經(jīng)定量PCR進(jìn)一步驗證和下游信號分析表明miR-26b確實參與MSCs定向遷移的調(diào)控[5]。FA在細(xì)胞遷移的過程中始終處于一個組裝-解聚-再組裝的動態(tài)過程中，而細(xì)胞遷移的狀態(tài)與FA在細(xì)胞中的分布及大小密切相關(guān)[12]。FA由多種FA相關(guān)蛋白如樁蛋白及黏著斑激酶(FAK)等組裝形成[13]。miR-26b通過影響與MSCs遷移相關(guān)的片狀偽足中FA的大小以及MSCs鋪展面積、極性指數(shù)來調(diào)控遷移。高表達(dá)miR-26b使MSCs細(xì)小FA數(shù)目增多，細(xì)小FA向細(xì)胞的前端周邊分布。說明miR-26b影響FA的大小及分布；同時使MSCs細(xì)胞面積變小，極性指數(shù)增大，細(xì)胞呈現(xiàn)極性分布，這些都為提高M(jìn)SCs的遷移能力提供了條件[14]。本研究顯示分化早期(7 d)的MSCs其趨化遷移能力最強(qiáng)，且遷移能力的強(qiáng)弱與miR-26b呈正相關(guān)。通過提高miR-26b的表達(dá)，可進(jìn)一步提高M(jìn)SCs的趨化遷移能力[15]。這為制備遷移能力更強(qiáng)的MSCs提供了實驗依據(jù)，為臨床MSCs移植采用何種分化狀態(tài)的細(xì)胞提供了參考。本研究表明miR-26b有助于促進(jìn)MSCs成肝樣分化。但體內(nèi)外由于微環(huán)境差異巨大，體外實驗可能并不能完全反映體內(nèi)的情況，項目組后續(xù)將從體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步明確miR-26b對MSCs的遷移、分化的影響，以期為MSCs對臨床肝病乃至其他疾病的治療提供實驗參考。