呂文遠,張 玲,王延秀,高清華,段 可**

(1.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院,上海 201306;2.上海市農(nóng)業(yè)科學院 林木果樹研究所,上海 201403;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學 園藝學院,甘肅 蘭州 730070)

草莓在我國的漿果植物種植中占有十分大的比例,為了提高草莓的風味和品質(zhì),研究人員從未間斷對草莓果實糖分相關因素的探索。糖不僅僅是果實甜度的指標,還是酸、色素、芳香物質(zhì)及其他營養(yǎng)成分的基礎原料[1]。草莓果實糖分積累以蔗糖、葡萄糖和果糖為主,其中蔗糖的積累主要來源于葉片光合產(chǎn)物的長距離運輸[2]；蔗糖運輸是由植物組織韌皮部中的篩管分子和伴胞共同作用完成的,而蔗糖跨膜轉(zhuǎn)運則需要膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(sucrose transporters, SUTs)的協(xié)助[3],因此草莓果實中的糖分調(diào)控因子蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在植物的生長代謝過程中起到了至關重要的作用。1992年Riesmeier等學者首次從菠菜中分離出SUT基因,自此科學家們對SUT相關功能的研究越來越深入。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白StSUT1定位于馬鈴薯塊莖的韌皮部[4]；馬鈴薯中的StSUT1在成熟葉片中高表達,在莖和發(fā)育葉片中的表達量較低[5]。番茄中的LeSUT1主要在韌皮部細胞中表達[6],這對蔗糖積累運輸起到了至關重要的作用；LeSUT2主要存在于庫器官中[7]；LeSUT4主要在子房和未成熟的果實中表達[8]。王利芬等發(fā)現(xiàn)白梨中的蔗糖轉(zhuǎn)運基因PbSUT2在番茄中過量表達,同樣可以提高番茄中蔗糖的積累量[9]。擬南芥中包含AtSUT1～AtSUT9共9個基因，它們在擬南芥中各個部位具有不同的表達量,發(fā)揮著不同的作用[10]。AtSUT1對于擬南芥花粉萌發(fā)以及蔗糖誘導花青素的積累具有十分重要的作用[11]；擬南芥中的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白AtSUT2相較于其他蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白親和力較低[12]；AtSUT5與擬南芥種子的成熟具有十分密切的聯(lián)系,在擬南芥花后4～9 d的種子發(fā)育階段高度表達[13]。AtSUT9與擬南芥中的其他蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白相比,對蔗糖具有極高的親和力,AtSUT9遍布于擬南芥的花和莖中,對擬南芥的花期也具有明顯的調(diào)節(jié)作用[14]。Frost等[15]在楊樹中發(fā)現(xiàn)PtaSUT4可參與植株水分調(diào)控，對植物響應水分脅迫具有明顯的作用。MdSUT4主要分布在蘋果的葉、花及幼果中,許海峰等得出結論：MdSUT4可能與蔗糖從液泡膜中的外排有關,并且有可能促進類黃酮的合成[16]。Berthier 等[17]在黑麥中發(fā)現(xiàn)LpSUT2基因?qū)χ仓曷淙~具有一定的影響。ZmSUT2能夠促進玉米生長發(fā)育過程中對蔗糖的利用,并且能夠大幅度地提高玉米的產(chǎn)量[18]。而TaSUT1A的過量表達可以大大提高小麥的耐旱性[19]。目前,對SUTs基因的研究已取得了較大的進展,但對SUT5基因的研究較少。

植物通過光合作用產(chǎn)生的蔗糖,一小部分用于自身代謝,其余大部分經(jīng)過韌皮部長距離運輸，最后到達庫組織[20]；另外,蔗糖還具有一定的信號調(diào)節(jié)功能,植物體內(nèi)的蔗糖在促進一些基因表達的同時也會遏制另一些基因的表達[21-22]。草莓果實的品質(zhì)是由果實中的糖分和酸共同調(diào)控決定的,因此草莓果實中的有機酸含量對草莓果實品質(zhì)的影響也十分重要,栽培草莓果實的可溶性有機酸主要為檸檬酸[23]和蘋果酸。本研究通過對“申陽”草莓果實中的蔗糖、果糖、葡萄糖以及檸檬酸和蘋果酸含量的測定，探究了FaSUT5基因過表達對草莓果實中可溶性糖以及有機酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

本研究以2016年10月種植于上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行試驗站塑料大棚中生長良好的草莓品種“申陽”(Fragaria × ananassa Duchesne Shenyang, ‘SY’)為試驗材料,選取胚發(fā)育一致的橫徑為18～20 mm的草莓大綠果,分別注射過表達載體35s: SUT5(pCAMBIA1300)或空載體35s: (pCAMBIA1300)的農(nóng)桿菌菌株,共2個處理，每個處理30個果實。

供試35s: (pCAMBIA1300)載體質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α (Escherichiacoli)與農(nóng)桿菌GV3101 (Agrobacterium)被保存于上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所生物技術課題組。

MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor購自Promega公司；T4-DNA連接酶購自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶SacI、SalI等購于上海諾寧生物科技有限公司；質(zhì)粒小抽試劑盒、DNA純化試劑盒購于Axygen公司；pUCm-T載體、Amp、Gen、Kan等購自上海生工公司；植物RNA提取試劑盒購于北京原平皓生物公司；SYBR GreenⅠ熒光染料、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司；其他化學藥品均購于國藥集團。引物由上海生工生物工程有限公司合成。RT全長引物及內(nèi)參參照張玲等[23]的方法進行設計。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆 以‘SY’為材料,利用同源克隆技術克隆FaSUT5全長基因和FaSUT5保守序列。根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫中已登錄的栽培草莓FaSUT5全長基因信息,設計FaSUT5全長引物及FaSUT5保守區(qū)域引物,以‘SY’草莓的cDNA為模板進行PCR擴增,將得到的符合預期目標大小的FaSUT5全長基因經(jīng)T4-DNA連接酶連接到pUCm-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR及質(zhì)粒酶切鑒定后均得到符合預期大小的目標條帶后,送陽性克隆至北京六合華大基因科技股份有限公司(上海)測序。

1.2.2FaSUT5過表達載體構建 采用SacI和SalI雙酶切體系消化FaSUT5正向插入pUCm-T載體的單克隆質(zhì)粒,純化回收FaSUT5全長基因后定向插入用相同限制性內(nèi)切酶處理的表達載體35s: (pCAMBIA1300),轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒PCR與質(zhì)粒酶切鑒定后,挑選陽性克隆測序。將測序鑒定FaSUT5過表達載體35s:FaSUT5(pCAMBIA1300)構建成功的質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞,2 d后挑取單克隆進行菌液PCR鑒定,保存陽性克隆用于草莓果實侵染試驗。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染草莓果實試驗 使用無菌牙簽在LB平板上分別挑取含有過表達載體35s:SUT5(pCAMBIA1300)或空載體35s:(pCAMBIA1300)的農(nóng)桿菌菌株,接種于5 mL YEP培養(yǎng)基(含有50 μg/mL Kan、50 μg/mL Rif和50 μg/mL Gen)中,在28 ℃下以250 r/min培養(yǎng)過夜；次日從中吸取500 μL菌液接種于50 mL YEP培養(yǎng)基(含有10 mmol/L MES、20 μmol/L AS、50 μg/mL Kan、50 μg/mL Rif和50 μg/mL Gen)中,于28 ℃下過夜培養(yǎng),搖菌至對數(shù)期(OD值為0.6～0.8),以4000 r/min離心10 min收集菌體。用侵染緩沖液(含有10 mmol/L MES、200 μmol/L AS、10 mmol/L MgCl2)重懸菌體,并調(diào)節(jié)菌液濃度至OD值為1.2～1.5,于28 ℃靜置3 h后，利用無菌注射器從果實蒂部注射200 μL菌液到草莓果實中,每天觀察果實的表形變化。

1.2.4FaSUT5表達分析 利用半定量RT-PCR分析FaSUT5在各生長時期處理樣品中的表達情況。以草莓的延伸因子FaEF1α為內(nèi)參基因,半定量反應體系為2×Taq Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNAs 2 μL,加水至終體積20 μL,充分混勻。用PCR儀進行PCR擴增,對所得產(chǎn)物進行凝膠電泳,對結果進行分析。

利用熒光定量PCR分析FaSUT5在過表達樣品中的表達情況,以草莓的延伸因子FaEF1α為內(nèi)參基因,定量反應體系為2×SYBR Premix DmerEraser 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNAs 2 μL,加水至終體積20 μL,充分混勻。用LightCycler 480實時定量PCR儀進行PCR擴增,對所得數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.5 果實可溶性糖和有機酸含量的測定 參照張玲等[25]的方法(本文略有改動)進行測定。

2 結果與分析

2.1 FaSUT5過量表達分析結果

通過實時定量RT-PCR分析草莓果實中FaSUT5 的表達,結果如圖1所示。與空載體注射相比較,注射了過表達載體的草莓果實中FaSUT5基因的相對表達量更高,說明SUT5對草莓果實糖分的積累具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

Blank1、Blank2為注射空載體的草莓果實(對照); OE1、OE2、OE3分別為注射過表達載體的草莓果實。圖1 草莓果實中FaSUT5表達的實時定量RT-PCR分析結果

2.2 FaSUT5表達對草莓果實中糖含量的影響

經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析[26-28],FaSUT5表達對草莓果實含糖量的影響如圖2所示。由圖2可見，注射了過表達載體的草莓果實中的蔗糖含量明顯高于注射了空載體的,而葡萄糖和果糖的含量在兩者間沒有明顯的差異。說明FaSUT5的表達可以明顯增加草莓果實中蔗糖的含量。

Blank1、Blank2為注射了空載體的草莓果實(對照);OE1、OE2、OE3分別為注射了過表達載體的草莓果實。差異顯著性分析在P<0.01水平下進行。下同。

圖2FaSUT5基因過表達對草莓果實中可溶性糖含量的影響

2.3 FaSUT5表達對草莓果實中酸含量的影響

FaSUT5對草莓果實中有機酸含量的影響如圖3所示。與對照相比，試驗組草莓果實中檸檬酸含量明顯減少,蘋果酸含量也有變化。說明FaSUT5的表達可以有效減少草莓果實中有機酸的積累。

3 小結與討論

植物中的SUTs基因?qū)χ参锏纳L發(fā)育有著極為重要的影響,并且不同的SUT基因作用于植物生長發(fā)育的不同階段。本研究證明了FaSUT5在申陽草莓果實的生長發(fā)育過程中,對蔗糖含量具有明顯的正向調(diào)控作用,并且可以降低草莓果實中主要有機酸的含量。這為通過糖酸比來改善草莓果實的品質(zhì)提供了理論依據(jù)，為SUTs家族其他相關基因的研究奠定了良好的基礎。本研究結果也與前人在其他作物上的研究結果[29-30]相吻合。

圖3 FaSUT5基因過表達對草莓果實中有機酸含量的影響