黃元清 苗登順 陳寧

放射治療是頭頸部惡性腫瘤綜合治療中有效方法之一，但腮腺輻射損傷引起口腔干燥是頭頸部放射治療的主要和常見(jiàn)并發(fā)癥之一[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Wang等[2]證實(shí)小鼠非致死性劑量的全身輻射(total body irradiation, TBI)能誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)中活性氧類(lèi)(reactive oxygen species, ROS)水平的升高，導(dǎo)致HSCs成熟前早衰。因此放射防護(hù)的關(guān)鍵是抑制氧化應(yīng)激清除過(guò)多的ROS防止DNA 損傷。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)首次在甲基營(yíng)養(yǎng)菌中被鑒定為一種乙醇和葡萄糖脫氫酶的新型輔因子，目前被認(rèn)為是一種重要的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)PQQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)為一種4,5-二羥基-4,5-二氧喹啉-2,7,9-三羧酸復(fù)合物[4]，被認(rèn)為是細(xì)菌葡萄糖脫氫酶氧化還原的輔因子，廣泛分布于植物、細(xì)菌、動(dòng)物、食物以及許多生物體液內(nèi)[5]，具有水溶性和熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)。

前期研究已經(jīng)證實(shí)[6]，PQQ作為抗氧化劑能部分糾正Bmi-1缺失誘導(dǎo)的頜骨和牙齒骨質(zhì)疏松。表明PQQ可能通過(guò)清除氧自由基ROS，從而延緩機(jī)體骨質(zhì)疏松。因此我們推測(cè)PQQ是否能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，降低ROS水平保護(hù)線(xiàn)粒體功能，從而對(duì)TBI引起小鼠腮腺損傷具有保護(hù)作用？

本研究利用TBI引起小鼠腮腺損傷的動(dòng)物模型，推測(cè)PQQ是否能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，降低ROS水平，從而發(fā)揮對(duì)腮腺輻射損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

本項(xiàng)研究經(jīng)過(guò)了南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)： BK2006576)。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠(8 周齡)購(gòu)買(mǎi)于南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠飼養(yǎng)在南京醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有試驗(yàn)程序均按照美國(guó)國(guó)立健康與倫理道德委員會(huì)以及關(guān)愛(ài)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的要求來(lái)進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將30 只雌性C57BL/6J 小鼠分成3 組，每組10 只將分別給予以下不同處理：對(duì)照組為普通飲食(含1%鈣、0.67%磷)飼養(yǎng)未經(jīng)TBI處理；TBI組為4 Gy TBI加普通飲食(含1%鈣、0.67%磷)飼養(yǎng)；PQQ治療組為4 Gy TBI+4 mg PQQ/kg普通飼料的小鼠作為實(shí)驗(yàn)組。

1.1.3 小鼠接受TBI的條件 小鼠置于有機(jī)玻璃盒內(nèi)，加蓋有孔，固定小鼠，背上腹下，通過(guò)直線(xiàn)加速器(Varian 600CD，F(xiàn)axitron Contact公司，德國(guó))從蓋上小孔行單劑量全身輻射，輻射時(shí)間為10 min，輻射劑量參照Dirix等研究[7]以4 Gy劑量行小鼠TBI可導(dǎo)致腮腺細(xì)胞損傷。

1.1.4 PQQ飲食補(bǔ)充劑量為4 mg PQQ/kg普通飼料，依據(jù)參照課題組前期研究[6]PQQ對(duì)小鼠頜骨和牙齒骨質(zhì)疏松影響的研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材 經(jīng)TBI后4 周，取3 組小鼠，斷頸處死。取右側(cè)腮腺使用能更好保存酶活性和組織抗原性的PLP(2%副醛，75 mol/L賴(lài)氨酸，10 mol/L過(guò)碘酸鈉) 固定液固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色、組織化學(xué)染色和免疫組化染色；取左側(cè)腮腺提取蛋白質(zhì)用于Western blot分析；另取一組的同側(cè)腮腺進(jìn)行流式細(xì)胞儀(BD Biosciences FACSCanto II,Becton, Dickinson and Co，美國(guó))檢測(cè)ROS水平。

1.2.2 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木精(Sigma，美國(guó))染色，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍(lán)，伊紅(Sigma，美國(guó))復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 取腮腺組織的石蠟切片進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋切片，進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、8-hydroxy-2’-deoxyguanosine(8-OH-dG)免疫組織化學(xué)染色以及TUNEL染色。

1.2.4 Western blot 取左側(cè)腮腺組織提取的蛋白質(zhì)，作Western blot分析，觀察細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，檢測(cè)指標(biāo)如下：SOD1、SOD2、P16、P19表達(dá)的變化。

1.2.5 流式細(xì)胞儀ROS水平檢測(cè) 用0.25%胰酶消化腮腺組織塊，制備單細(xì)胞懸液，加入ROS敏感的熒光探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酯(DCF-DA)，流式儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光探針平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件對(duì)腮腺組織的計(jì)量資料3 組間的總體比較和兩兩比較分別進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Image Pro Plus圖像處理與分析軟件分析組化染色圖像。

2 結(jié) 果

2.1 PQQ對(duì)TBI誘導(dǎo)的腮腺形態(tài)損傷的作用

與正常小鼠腮腺HE染色比較觀察發(fā)現(xiàn)：10 只經(jīng)4 Gy TBI后第30天小鼠腮腺腺泡細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂，腺泡細(xì)胞萎縮、消失、導(dǎo)管擴(kuò)張，可見(jiàn)脂肪空泡變性。而與4 Gy TBI組相比較，4 Gy TBI+PQQ組(圖 1)小鼠腮腺腺泡細(xì)胞增多，排列較規(guī)則，間質(zhì)中脂肪空泡性變改善。這些數(shù)據(jù)表明PQQ對(duì)TBI誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠腮腺形態(tài)損傷具有糾正作用。

圖 1 PQQ對(duì)TBI誘導(dǎo)的腮腺損傷形態(tài)學(xué)的作用 (HE, ×400)

Fig 1 The effects of PQQ on the morphology of parotid glands induced by TBI (HE, ×400)

2.2 PQQ對(duì)TBI誘導(dǎo)小鼠腮腺間質(zhì)纖維化的作用

Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4 Gy輻射組小鼠腮腺纖維化程度明顯高于未輻射組，然而，飲食補(bǔ)充PQQ明顯減少了間質(zhì)纖維化面積(圖 2)，這些數(shù)據(jù)表明PQQ減少TBI小鼠腮腺間質(zhì)纖維化的作用。

2.3 PQQ對(duì)TBI小鼠腮腺細(xì)胞增殖的影響

代表增殖細(xì)胞標(biāo)志物PCNA的免疫組化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TBI小鼠腮腺間質(zhì)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯較未被輻射組小鼠減少。而PQQ具有明顯增加TBI小鼠腮腺間質(zhì)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比的作用(圖 3)。表明PQQ具有促進(jìn)TBI小鼠腮腺細(xì)胞增殖的作用。

圖 2 PQQ 對(duì)小鼠腮腺間質(zhì)纖維化的作用 (Masson染色, ×200)

Fig 2 The effects of PQQ on the stromal fibrosis of parotid glands (Masson staining, ×200)

圖 3 PQQ 對(duì)損傷腮腺細(xì)胞增殖的影響 (×400)

Fig 3 The effects of PQQ on the cell proliferation of damage parotid glands (×400)

2.4 PQQ對(duì)TBI小鼠腮腺細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBI小鼠腮腺中表示凋亡的細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯較未被輻射組小鼠增加。而PQQ具有明顯減少TBI小鼠腮腺細(xì)胞TUNAL陽(yáng)性細(xì)胞百分比的作用(圖 4)。表明PQQ具有減少TBI小鼠腮腺細(xì)胞凋亡的作用。

圖 4 PQQ 對(duì)受損腮腺細(xì)胞凋亡的影響 (TUNEL 染色， ×400)

Fig 4 The effects of PQQ on the cell apoptosis of impaired parotid glands (TUNEL staining， ×400)

2.5 PQQ對(duì)TBI小鼠腮腺DNA損傷的影響

代表DNA損傷標(biāo)志物8-OH-dG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TBI小鼠腮腺細(xì)胞8-OH-dG陽(yáng)性百分比明顯較未被輻射組小鼠增加。而PQQ具有明顯減少TBI小鼠腮腺細(xì)胞8-OH-dG陽(yáng)性細(xì)胞百分比的作用(圖 5)。以上數(shù)據(jù)表明PQQ具有減少TBI小鼠腮腺細(xì)胞DNA損傷的作用。

2.6 Western blot

結(jié)果發(fā)現(xiàn)PQQ具有上調(diào)各種抗氧化蛋白的作用。且具有抑制各種細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑的作用(圖 6)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)揮對(duì)TBI小鼠腮腺損傷的保護(hù)作用。

圖 5 PQQ 對(duì)TBI誘導(dǎo)腮腺DNA損傷的修復(fù)作用 (×400)

Fig 5 The effects of PQQ on the DNA damage of parotid glands induced by TBI (×400)

圖 6 PQQ對(duì)輻射后腮腺抗氧化蛋白、細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)作用

2.7 PQQ對(duì)受損腮腺組織ROS 水平的調(diào)節(jié)作用

為了驗(yàn)證PQQ是否通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，降低ROS水平，從而對(duì)TBI小鼠腮腺起損傷保護(hù)作用，取小鼠腮腺進(jìn)行流式細(xì)胞ROS的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TBI小鼠腮腺組織ROS 水平明顯較未被輻射組升高，而飲食補(bǔ)充PQQ確實(shí)具有降低ROS水平的作用(圖 7)。

圖 7 PQQ 對(duì)輻射后腮腺組織ROS水平的調(diào)節(jié)作用

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明[8]，X-射線(xiàn)輻射能減少天然抗氧化劑維生素E的產(chǎn)生。在本研究中，我們利用全身輻射導(dǎo)致小鼠腮腺損傷動(dòng)物模型，驗(yàn)證PQQ作為抗氧化劑是否具有防止腮腺損傷的作用。結(jié)果證明飲食補(bǔ)充PQQ治療經(jīng)TBI 后的C57BL/6J小鼠可明顯減少腮腺損傷。

研究表明，經(jīng)TBI小鼠24 h內(nèi)腮腺早期受損表現(xiàn)為唾液量減少以及腮腺重量減輕[9]。然而，在臨床上目前仍未找到一種合適藥物來(lái)治療輻射引起的腮腺損傷，因而研究者開(kāi)始關(guān)注一種抑制或減少DNA損傷的輻射保護(hù)劑。這種輻射保護(hù)劑直接靶向減少電離輻射和活體組織中的氧自由基的形成[10]。作為一種強(qiáng)抗氧化劑，PQQ 可能具有清除氧自由基防止輻射引起腮腺分泌細(xì)胞損傷的作用[11-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)飲食補(bǔ)充PQQ確實(shí)對(duì)受損腮腺具有保護(hù)作用。主要表現(xiàn)在：PQQ通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和DNA損傷糾正了受損腮腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)，然而PQQ發(fā)揮作用的分子機(jī)制目前尚未清楚；進(jìn)一步的研究表明PQQ不僅抑制細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑和凋亡基因，而且上調(diào)不同抗氧化蛋白；同時(shí)也證明了PQQ能減少受損腮腺的ROS 水平?？傊?，PQQ 作為抗氧化劑能夠抑制氧化應(yīng)激減少ROS水平，同時(shí)通過(guò)下調(diào)p19, p16-Rb信號(hào)通路延緩細(xì)胞衰老。因而PQQ 對(duì)受損腮腺組織具有保護(hù)作用。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PQQ對(duì)全身輻射誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠腮腺損傷具有保護(hù)作用；并進(jìn)一步闡明PQQ可能通過(guò)上調(diào)抗氧化能力、抑制氧化應(yīng)激、減少ROS水平參與DNA損傷修復(fù)作用，從而發(fā)揮對(duì)受損腮腺的輻射保護(hù)作用。為PQQ在輻射保護(hù)臨床新藥的研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。