苑 博 馬海英 王 穎

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110032）

頭痛寧膠囊由天麻、土茯苓、制何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)和全蝎六味中藥制成，具有熄風(fēng)滌痰、逐瘀止痛的功效，臨床效果顯著[1-3]。天麻為方中主藥，筆者建立了HPLC法測(cè)定頭痛寧膠囊中天麻素的含量，方法專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確度高，可用于頭痛寧膠囊中天麻素的測(cè)定。測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度相關(guān)的參數(shù)，可以表征合理的測(cè)量結(jié)果的分散性[4-7]，可以綜合判定測(cè)量結(jié)果質(zhì)量，評(píng)定測(cè)量條件和測(cè)量方法的可靠性，目前還沒有頭痛寧膠囊中天麻素含量不確定度文章報(bào)道。本研究結(jié)合CNAS-GL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中規(guī)定的程序，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定頭痛寧膠囊中天麻素含量的不確定分析，對(duì)測(cè)量過程中影響測(cè)量結(jié)果的因素進(jìn)行考察，分析了各不確定度分量對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，計(jì)算出測(cè)量結(jié)果的不確定度，為測(cè)量結(jié)果的評(píng)定提供可靠性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）； 超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）； 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110807）；乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）；頭痛寧膠囊（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)為170456）。其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸 （2∶98（v/v））；流速1.0 mL·min-1；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；樣量20μL。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取天麻素對(duì)照品13.10 mg，置于10 mL容量瓶中用流動(dòng)相溶解定容，制成濃度為1.31 mg/mL的天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取適量天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成濃度為1.31、6.55、13.10、26.20、52.40和104.80 mg/L的天麻素對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 取10粒頭痛寧膠囊內(nèi)容物，混勻研細(xì)，精密稱取0.5 g置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇20 mL混勻，超聲波提取15 min，超聲波提取溫度為40℃，冷卻定容，過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。將對(duì)照品溶液和供試品溶液按照色譜分析條件分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算天麻素含量。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與結(jié)果計(jì)算方法 用外標(biāo)法計(jì)算頭痛寧膠囊中天麻素的含量，其數(shù)學(xué)模型見公式式中，X是頭痛寧膠囊中天麻素的含量（mg/g），C是天麻素色譜峰面積由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的天麻素濃度（mg/L），m為試樣質(zhì)量（g），V為定容體積（mL）。天麻素濃度（C）與含量（X）之間存在線性關(guān)系，根據(jù)這一模型即可進(jìn)行定量分析。

2.2 不確定度來源因果圖 從測(cè)量模型上分析，評(píng)估影響測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度的各個(gè)不確定度分量，如圖1所示。

圖1 高效液相色譜法測(cè)定頭痛寧膠囊中天麻素含量的不確定度來源

2.3 不確定度的來源識(shí)別 根據(jù)測(cè)定天麻素的數(shù)學(xué)模型分析，其測(cè)量不確定度主要有以下幾個(gè)環(huán)節(jié)引入，分別是由標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制和稀釋、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品重復(fù)性測(cè)定、試樣稱量、試液定容和回收率引入的不確定度。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制所引入的不確定度u1經(jīng)查天麻素標(biāo)準(zhǔn)品證書上天麻素純度為（99.5±1.0）%，標(biāo)準(zhǔn)品純度所引入的不確定度。使用AL204型電子分析天平稱量天麻素標(biāo)準(zhǔn)品，稱量結(jié)果的示值誤差擴(kuò)展不確定度由天平的校準(zhǔn)證書獲得U=0.05 mg（k=2），標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為13.10 mg，則天平稱量不確定度為。使用10 mL容量瓶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容，由校準(zhǔn)證書可知，擴(kuò)展不確定度U=0.01 mL（k=2），由容量瓶定容引入的不確定度。綜合以上結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所引入的不確定度

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋所引入的不確定度u2標(biāo)準(zhǔn)溶液采用5 mL移液管轉(zhuǎn)移稀釋，查移液管的標(biāo)準(zhǔn)證書，其擴(kuò)展不確定度U=0.005 mL（k=2），由移液器所引入的不確定度。10 mL容量瓶所引入的不確定度。綜合以上結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋所引入的不確定度。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u3以天麻素標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋配制的6種標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (m=6)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定3次 (n=18)，擬合得線性回歸方程A=KC+b（K為1397.3，b為5.9771），相關(guān)系數(shù)為0.9998。取某標(biāo)準(zhǔn)品液重復(fù)測(cè)定3次計(jì)算出平均質(zhì)量濃度C0=6.55 mg/L。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品濃度和響應(yīng)值見表1，經(jīng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差式中為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)值， 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的理論響應(yīng)值，n為標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)。因此，由天麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度可表示為，其中p為對(duì)C0的測(cè)定次數(shù)，c為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均濃度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)量結(jié)果

2.3.4 樣品重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度u4按照1.4項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品平行操作，進(jìn)行了8次重復(fù)測(cè)定，測(cè)定結(jié) 果 為 1.281、 1.279、 1.283、 1.281、 1.278、 1.279、1.286和1.282 mg/g，平均值X=1.281mg/g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為S（X） 0.003 mg/g，RSD為0.21%。由重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3.5 樣品稱量引入的不確定度u5使用AL204型電子分析天平稱量樣品，由天平的校準(zhǔn)證書獲得稱量結(jié)果的示值誤差擴(kuò)展不確定度U=0.05 mg（k=2），樣品質(zhì)量為500.0 mg，則天平稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.6 樣品定容體積引入的不確定度u6使用25 mL容量瓶對(duì)樣品供試液定容，由校準(zhǔn)證書可知，擴(kuò)展不確定度U=0.01 mL（k=2），由容量瓶定容引入的不確定度。試驗(yàn)時(shí)溫度控制在（20±5） ℃，假設(shè)溫度為矩形分布，溫度變化5℃引起的不確定度可由溫度范圍和體積膨脹系數(shù)計(jì)算，其中供試液的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，本次只考慮的體積膨脹，換算系數(shù)為 ，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，溫度變化所引入的不確定度可表示為。因此樣品定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.7 回收率引入的不確定度u7在頭痛寧膠囊中填加0.254 mg/g的天麻素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行測(cè)定6次，經(jīng)計(jì)算回收率結(jié)果為96.94%、96.17%、99.23%、98.47%、99.68%和100.29%，平均回收率R=98.46%。，由回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。采用t檢驗(yàn)法，對(duì)平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，經(jīng)查t檢驗(yàn)臨界值分布表，t大于t95.5（2.58），回收率有顯著性差異，天麻素的含量需要校正才能得出更準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度 通過對(duì)各個(gè)不確定度分量的分析和計(jì)算，天麻素含量測(cè)定結(jié)果的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為其合成不確定度可表示為mg/g。取95%置信水平，k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為mg/g。實(shí)驗(yàn)測(cè)得頭痛寧膠囊中天麻素的平均值為X=1.281 mg/g，則天麻素含量可表示為（1.28±0.027） mg/g。

4 總結(jié)

各不確定度分量對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響各不相同，其中對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大的因素有標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和回收率引入的不確定度。其次為稀釋定容和樣品重復(fù)性測(cè)定，試樣稱量引入的不確定度相對(duì)較小。因此在實(shí)際工作中做好工作曲線的繪制與擬合，測(cè)量結(jié)果進(jìn)行回收率校正，可以有效地提高測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度。