于佳動，趙立欣，馮 晶，姚宗路，黃開明，羅 娟

（農業(yè)農村部規(guī)劃設計研究院農村能源與環(huán)保研究所，農業(yè)農村部農業(yè)廢棄物能源化利用重點試驗室，北京 100125）

0 引 言

厭氧發(fā)酵生產沼氣是中國綠色農業(yè)發(fā)展過程處理農業(yè)廢棄物的重要手段。隨著中國沼氣工程轉型升級工作的深入推進，規(guī)模化大型沼氣工程和規(guī)?；锾烊粴夤こ坛蔀檎託夤こ探ㄔO的主流[1]。目前，中國農業(yè)廢棄物沼氣工程普遍采用濕法厭氧發(fā)酵技術，工藝較為成熟，運行過程容積產氣率保持在0.8～1.0 m3/(m3·d)[2]。隨著原料收集方式的改變，特別是養(yǎng)殖場干清糞收集方式的普遍應用，提高了原料的含固率，為干法厭氧發(fā)酵技術的推廣創(chuàng)造了條件，高效、穩(wěn)定的產氣工藝是干法厭氧發(fā)酵推向規(guī)模化應用的關鍵。

干法厭氧發(fā)酵具有提高廢棄物處理量、降低能耗、提高容積產氣率等優(yōu)點。而且，發(fā)酵過程沼液產量少，沼渣可直接用于有機肥的生產，大大提升了農業(yè)種養(yǎng)結合的良性循環(huán)能力[3]。國外發(fā)展干法厭氧發(fā)酵技術起步較早，20世紀90年代，歐洲干法厭氧發(fā)酵沼氣工程占有率近50%，法國Valorga、比利時Dranco、瑞典Kompogas等公司的連續(xù)干發(fā)酵工藝，以及德國BEKON、Bioferm、GICON公司的序批式厭氧干發(fā)酵工藝已產業(yè)化[4-5]。隨著工程建設技術的不斷完善，序批式厭氧干發(fā)酵技術在處理富含纖維的農業(yè)廢棄物方面具有獨特的優(yōu)越性，通過鏟車等機械設備一次性進出料，在密封空間內實現(xiàn)高效產氣，操作簡單、自動化程度高，運行成本低[5]。然而，中國對序批式干法厭氧發(fā)酵技術研究雖然起步較早，但發(fā)展緩慢，特別是利用序批式厭氧發(fā)酵處理農業(yè)廢棄物方面，還未見有落地工程報道，其中最主要的原因是對影響序批式厭氧干發(fā)酵產氣特性的關鍵因素尚不明確，影響了工藝優(yōu)化效率。

含固率、物料配比、接種物濃度等是影響序批式厭氧干發(fā)酵產氣效率的重要因素[6]，已有研究對影響序批式厭氧干發(fā)酵產氣效率的研究僅集中在 1～2個因素，并缺乏有效關聯(lián)[7-8]。而且，噴淋是序批式厭氧發(fā)酵增加傳質的主要方式，對噴淋頻率、噴淋量的研究卻很少考慮其他因素的影響[9]。因此，本研究提出將影響序批式厭氧干發(fā)酵效率的因素相結合，整體探究影響序批式厭氧干發(fā)酵性質的關鍵因素，并對微生物群落進行分析，揭示其與各因素間的相互作用關系，為下一步準確研究序批式厭氧干發(fā)酵沼氣生產工藝提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用農業(yè)廢棄物為玉米秸稈和牛糞。玉米秸稈來自河北省張家口市崇禮縣農田，放置室溫（25 ℃）通風處保存，混料前測得TS、VS分別為90.71% ± 0.06%、76.28% ± 0.09%；牛糞取自河北省廊坊市三河市內牛場，取回后進行風干處理，以調節(jié)試驗設定的含固率。并且，前期通過預試驗證明，風干后的牛糞不會對物質組分造成顯著性影響。牛糞TS為56.78% ± 0.25%，VS為46.32%±0.13%；接種污泥取自北京市順義區(qū)趙全營鎮(zhèn)北郎中村沼氣廠，混料前，取適量污泥在（38 ± 0.5）℃的厭氧條件下培養(yǎng)至不產氣，測得TS為31.15% ± 0.15%，VS為17.46% ± 0.18%。

1.2 反應裝置

序批式厭氧干發(fā)酵反應器為有機玻璃材質，有效體積10 L，物料填裝在孔徑5 mm的篩網(wǎng)盤上，垂直物料上方中心處設有噴淋頭，噴孔孔徑為0.3 mm，向物料表面噴灑滲濾液，滲濾液延滲濾管流入5 L的滲濾液收集罐；反應器有循環(huán)水夾層，通過熱水浴循環(huán)維持反應器發(fā)酵溫度；收集的滲濾液經回流管道由蠕動泵控制回流噴淋；產生的沼氣流經濕式氣體流量計計數(shù)，并用集氣袋進行收集。

1.3 試驗設計

以秸稈和牛糞為混合原料，含固率、物料配比、接種物濃度、秸稈粒徑，以及噴淋頻率、噴淋量為因素，采用Plackett-Burman設計法[10]，共設計12組試驗，因素內的最低值和最高值是根據(jù)國內外報道的序批式厭氧干發(fā)酵各因素試驗參數(shù)范圍設定的[6,8-9]，如表1所示。玉米秸稈粉碎至1、5 cm兩種粒徑，進料后，密封反應器，發(fā)酵溫度為（38 ± 0.5）℃，滲濾液回流噴淋頻率和噴淋量由時間繼電器自動控制，12組序批式厭氧干發(fā)酵反應裝置同時運行，試驗周期為40 d。

表1 12組序批式厭氧干發(fā)酵試驗設計表Table 1 Experimental design for 12 groups of batch dry anaerobic digestion

1.4 分析方法

TS、VS測定參照美國 APHA方法[11]。試驗運行過程中，每天記錄氣體流量計讀數(shù)，即沼氣產量（L）。使用便攜式沼氣成分分析儀（Biogas check，Geotech，英國）測定沼氣中的甲烷含量（CH4%）。使用便攜式 pH計（SX-610，上海三信，中國）和ORP計（SX-630，上海三信，中國）監(jiān)測發(fā)酵過程的pH值和ORP（氧化還原電位）。采用氣相色譜法分析發(fā)酵周期結束時反應器內物料乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸共 6種有機酸組分，測試前樣品需12 000 r/min離心30 min，取上清過0.22 μm濾膜，過濾后的液體與甲酸1:1混合后上機測試，測定程序及方法參照文獻[12]。采用Miseq高通量測序技術，對發(fā)酵周期內物料細菌、古菌特征進行測序評價，在Majorbio有限公司（中國上海）對抽平后的測序結果進行微生物屬水平進行群落結構分析[13]。

基礎數(shù)據(jù)處理、顯著性差異分析基于Microsoft Office 2016軟件平臺，對不同因素貢獻度的計算分析使用Design-Expert v8.0軟件[10]，使用Canoco v4.5對不同因素作用下測定的發(fā)酵指標進行典型相關性分析。

2 結果與分析

2.1 序批式厭氧干發(fā)酵產氣特性

不同因素組合條件下的12組序批式厭氧干發(fā)酵日產沼氣性質如圖1a、b所示，發(fā)酵第1天，產氣出現(xiàn)高峰，第5天時，反應器A、C、D、E的容積產氣率開始不同程度回升，平均容積產氣率（L/(L·d)）排序為E（1.52）＞D（1.02）＞C（0.88）＞A（0.80），反應器L在發(fā)酵第7天后容積產氣率不再下降，維持在(0.70 ± 0.20) L/(L·d)，而其他反應器均無明顯的產氣現(xiàn)象。從多因素組合中可以看出，除反應器L外，反應器A、C、D、E、L反應器產氣明顯，噴淋頻率均為間隔2 h噴淋，反應器A、E在發(fā)酵6～13 d產氣呈升高趨勢，隨后A開始逐漸下降，而E在前27天均可維持較高的產氣水平，與反應器A相比，反應器E原料中牛糞含量高，間接增加了接種物數(shù)量[14]，秸稈粒徑增大，降低了秸稈快速水解產酸對反應體系的沖擊[15]。反應器C和D在經歷5～15 d的延滯期后容積產氣率上升，隨后反應器C容積產氣率逐漸平穩(wěn)，而反應器D持續(xù)上升，在發(fā)酵30 d后出現(xiàn)第2次產氣高峰，與反應器C相比，反應器D含固率、牛糞比例高，秸稈粒徑小，且接種物濃度為反應器C的5倍，雖然干發(fā)酵過程中含固率過高易引起沼氣產量的下降，但若保證充足的接種物數(shù)量有助于反應體系恢復產氣[16]。噴淋頻率高可顯著促進序批式厭氧干發(fā)酵容積產氣效率的提升（P＜0.01），增加噴淋頻率可提高序批式干發(fā)酵體系接種物的流動性，通過潤濕物料，促進微生物的傳質效率，有利于沼氣生產[9]。

甲烷含量如圖1c、d所示，發(fā)酵前10天，不同反應器的甲烷體積分數(shù)均在50%以下，反應器A、E的甲烷體積分數(shù)升高明顯，10 d后保持在50%以上，穩(wěn)定在54.17%± 2.50%和57.50% ± 3.24%，反應器C、D甲烷含量升高緩慢，到發(fā)酵第15和18天甲烷體積分數(shù)上升到50%以上，反應器 L雖然也有甲烷生成，但整個發(fā)酵過程甲烷體積分數(shù)不超過42.40%，其他反應器在前5天可檢測到少量甲烷，但由于干發(fā)酵初期甲烷菌活性低、生長速率慢[14]，伴隨著體系不產氣，甲烷含量為0。

圖1e、f顯示了多因素組合下序批式厭氧干發(fā)酵反應器日產甲烷特性，反應器A、C、D、E和L甲烷生成明顯，與日產沼氣變化規(guī)律相比，發(fā)酵初期由于甲烷體積分數(shù)低，并不存在產甲烷高峰，發(fā)酵5 d后，甲烷產量上升明顯，其中反應器E高效產甲烷一直維持到第27天，其他反應器甲烷產量變化趨勢與日產沼氣規(guī)律相同，容積產甲烷率（L/(L·d)）為 E（0.70）＞D（0.36）＞C（0.33）＞A（0.30）＞L（0.26）。噴淋頻率高、接種物濃度高、原料中牛糞比例增加均促進甲烷產量的提升。

圖1 序批式厭氧干發(fā)酵容積產氣率和甲烷含量Fig. 1 Volumetric biogas and methane production rate and methane content of batch dry anaerobic digestion

2.2 不同因素對序批式厭氧干發(fā)酵產甲烷特性的貢獻度分析

多因素影響序批式厭氧干發(fā)酵容積產氣率的貢獻度如圖 2所示，噴淋頻率對甲烷生產的貢獻度最大，為30.84% ± 1.89%，是序批式厭氧干發(fā)酵工藝優(yōu)化的重要環(huán)節(jié)。滲濾液的循環(huán)噴淋可帶回大量微生物，通過噴淋可減少接種物的用量，并且為微生物提供主動的轉移機制，有助于干發(fā)酵體系微生物快速生長及群落結構穩(wěn)定，提高微生物的活性，進而增加有機物降解效率，促進甲烷生產[17]。由于干發(fā)酵反應器不適合安裝攪拌裝置，所以，歐洲目前運行的大型序批式厭氧干發(fā)酵沼氣工程普遍裝有噴淋設施提升傳質能力，促進沼氣的高效穩(wěn)定生產[4]。另外，其他因素對序批式厭氧干發(fā)酵甲烷生產貢獻度的排序依次為接種物質量分數(shù)（24.96% ± 1.16%）＞含固率（9.95% ± 0.89%）＞物料配比（7.00% ±2.34%）＞秸稈粒徑（5.16% ± 0.89%）＞噴淋量（0.1% ± 0.03%），可見，圍繞序批式厭氧干發(fā)酵高效產甲烷工藝的研究，應首先設法通過直接增加接種量或間接調節(jié)噴淋頻率以促進接種物與底物間的接觸，提高接種效率和甲烷產量[7,9]。從本研究可以看出，提升接種效率并促進甲烷生產最有效的方法是直接添加接種物和調節(jié)噴淋頻率。而且，各因素間存在一定的交互作用關系，含固率和物料配比以及含固率和接種物濃度的共同作用對甲烷產量的提高也具有明顯的貢獻。所以，在對以農作物秸稈和畜禽糞便混合原料進行序批式厭氧干發(fā)酵產甲烷工藝優(yōu)化時，噴淋頻率和接種物濃度應是首先被考慮的優(yōu)化因素。當干發(fā)酵體系含固率為25%、秸稈-牛糞TS配比為3:7、接種物質量分數(shù)（TS質量分數(shù)）為50%、秸稈粒徑為1 cm、噴淋頻率為間隔2 h，噴淋量為4 L時，可顯著提高容積產氣效率（P＜0.05）

圖2 不同因素對序批式厭氧干發(fā)酵甲烷生產的貢獻度Fig. 2 Contribution rate of different factors to methane production in batch dry anaerobic digestion

2.3 不同因素作用下序批式厭氧干發(fā)酵有機酸分布特性

序批式厭氧干發(fā)酵運行周期結束時，有機酸濃度及組成如表2所示，除了反應器B、F，在其他噴淋頻率高的反應器中有機酸質量濃度均不超過 1.84 g/L，Siegert等研究了有機酸累積對厭氧發(fā)酵體系甲烷生產的影響指出，當體系有機酸累積超過2.0 g/L，開始抑制產甲烷菌的生長，有發(fā)生酸敗的風險[18]。本研究中，高噴淋頻率反應器（A～F），高接種物濃度及牛糞比例的反應器可及時將體系的有機酸轉化為沼氣（甲烷）。從有機酸組分濃度上看，發(fā)酵過程發(fā)生酸敗的反應器B、F、G、H、I、J、K，丙酸濃度顯著高于其他有機酸組分（P＜0.05），并且丁酸濃度也發(fā)生一定的積累。研究表明，丙酸積累引起厭氧發(fā)酵體系pH值降低，影響產甲烷活性，在沖擊負荷或超負荷情況下會使發(fā)酵由丁酸型向丙酸型轉化，從生物學角度分析，較高的有機負荷條件下丁酸型發(fā)酵的代謝加快，這伴隨著較高的NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài))產量，如果這些NADH不能及時的被細胞合成所利用，則導致NADH的積累，必須通過產丙酸途徑加以緩解。在本研究中，發(fā)生酸敗的反應器總酸產量高使體系pH值降低，導致乙酸代謝受到抑制，丙酸和丁酸發(fā)生積累[19]。另外，鄧玉營等[20]在研究秸稈干發(fā)酵過程沼液回流比和有機負荷對厭氧發(fā)酵特性的影響中發(fā)現(xiàn)，嚴重酸敗的干發(fā)酵反應器中，丙酸、丁酸發(fā)生明顯的積累，其中丙酸累積質量濃度高達6.54 g/L。

表2 序批式厭氧干發(fā)酵有機酸及其組分質量濃度Table 2 Organic acid and their component concentration in batch dry anaerobic digestion mg·L-1

2.4 不同因素作用下序批式厭氧干發(fā)酵細菌、古菌組成特性

為了更加深入的揭示序批式厭氧干發(fā)酵關鍵因素對甲烷生產的影響，依托高通量測序技術對各反應器中的關鍵細菌、古菌群落進行分析，如圖3a所示（細菌），屬水平 Ruminofilibacter、Hydrogenispora、Ruminiclostridium豐度隨著反應器甲烷產量的提高而顯著增加，在反應器A、C、D、E、L中的豐度分別為 9.30%～33.70%、6.30%～11.00%、8.50～14.90%。3種細菌均為木質纖維素分解菌，經常出現(xiàn)在以秸稈為原料的厭氧發(fā)酵體系中，特別是Ruminofilibacter、Ruminiclostridium，通過分泌大量纖維素、半纖維素酶水解木質纖維素，生成以乙酸、丁酸為主的適合產甲烷菌利用的酸化產物，促進產甲烷效率[13,21]。另外，在本研究中，Clostridium豐度升高不利于甲烷生產，Clostridium在低pH值環(huán)境依然有較強的水解產酸能力，在中溫環(huán)境中，Clostridium的過多出現(xiàn)預示著反應體系的酸敗[21-22]。在2.2節(jié)中，揭示了增加噴淋、提高接種物濃度是序批式厭氧干發(fā)酵產甲烷的關鍵因素，含固率、物料配比（牛糞多）、接種物濃度間也具有一定的協(xié)同作用關系，導致了序批式厭氧干發(fā)酵體系細菌群落的變化，表現(xiàn)為Clostridium的生長受到抑制，提 高 了 Ruminofilibacter、 Hydrogenispora、Ruminiclostridium豐度水平。另外，一種具有高效分解木質纖維素能力的 Paeniclostridium[21]，在噴淋頻率低的反應器中略有升高。在圖3b顯示的不同反應器的產甲烷菌豐度中，Methanosarcina為優(yōu)勢古菌，豐度為 62.4% ±12.8%，幾乎不受各因素的影響。Methanosarcina為嗜乙酸型產甲烷菌，抗逆性較強，是干發(fā)酵體系的優(yōu)勢古菌，可高效利用有機酸轉化為甲烷[23]。此外，另一種嗜乙酸型產甲烷菌Methanoculleus的平均豐度為9.6% ± 5.1%，體系內嗜乙酸產甲烷菌的平均豐度達到72.0% ± 17.9%?？梢姡饕蛩刈饔糜谛蚺絽捬醺砂l(fā)酵體系主要通過改變細菌群落影響產甲烷潛力，對古菌的影響較弱。

圖3 序批式厭氧干發(fā)酵細菌、古菌群落特征Fig. 3 Characteristics of bacteria and archaea community in batch dry anaerobic digestion

2.5 序批式厭氧干發(fā)酵影響因素與發(fā)酵性質及微生物群落間的相互作用關系

如圖 4所示，各反應器在不同因素作用下，噴淋頻率和接種物濃度與沼氣產量、甲烷產量存在顯著的正相關協(xié)同作用關系（P＜0.01），秸稈粒徑也與產氣呈正相關性，但影響較小，反應器A、C、D、E隨著噴淋頻率、接種物濃度的提高容積產氣率明顯提升（2.1節(jié)），pH值為7.0 ± 0.1，受到噴淋頻率低的影響，反應器L的pH值僅為 6.7，產氣效率下降（2.1節(jié)）。Ruminofilibacter、Hydrogenispora、Ruminiclostridium豐度的提高，有利于序批式厭氧干發(fā)酵體系的甲烷生產，并與噴淋頻率和接種物濃度呈正相關性。當體系含固率增加，物料配比中秸稈比例高、提高噴淋量將不利于甲烷生產，易引起反應體系的酸敗，與有機酸產量保持正相關性，但三者與噴淋頻率間存在正相關協(xié)同作用關系，特別是物料配比與噴淋量，提高物料配比中牛糞的比例和噴淋量有利于甲烷產量的提升。Degueurce 等研究牛糞序批式厭氧干發(fā)酵產氣特性中證實，提高體系的含固率需縮短噴淋間隔、提高噴淋量，以便及時去除體系中積累的有機酸，防止產氣抑制的發(fā)生[24]。另外，pH值和氧化還原電位（ORP）呈負相關性，當體系有機酸發(fā)生積累，ORP增加，預示著體系傳質能力受到了抑制[21]，在本研究中，噴淋頻率低的反應器中ORP值普遍較高，也反映出噴淋對提高序批式厭氧干發(fā)酵產氣能力的重要性。Methanosarcina對提高產氣效率具有正相關性，提高含固率和物料中秸稈的比例可促進Methanoculleus生長，但2.4節(jié)中研究表明，古菌在序批式厭氧干發(fā)酵過程對發(fā)酵性質的影響較小，維持甲烷的高效生產，細菌群落起關鍵作用。通過RDA分析，進一步明確了各因素間的相互作用關系以及給發(fā)酵體系帶來的影響，可為今后序批式厭氧干發(fā)酵工藝優(yōu)化提供參考。

圖4 微生物與環(huán)境因子間的RDA分析Fig.4 RDA analysis between microorganism and environment

3 結 論

1）噴淋頻率、接種物濃度對促進序批式厭氧干發(fā)酵容積產甲烷率的貢獻度最大，分別為30.84%和24.96%，適當?shù)奶岣邍娏茴l率、接種物濃度和原料配比中牛糞的比例都有利于促進序批式厭氧干發(fā)酵體系產甲烷效率，高效產氣可持續(xù)27 d，容積產甲烷率達0.70 L/（L·d）。

2）細菌群落對序批式厭氧干發(fā)酵產氣特性影響顯著（P＜0.05），在產氣效果良好的反應器中Ruminofilibacter，Hydrogenispora，Ruminiclostridium 豐度明顯提高，而古菌不受噴淋頻率、接種物濃度和秸稈牛糞配比的影響，Methanosarcina為優(yōu)勢古菌。

3）適當提高噴淋頻率、接種物濃度均可提高Ruminofilibacter，Hydrogenispora，Ruminiclostridium 豐度和體系容積產甲烷率，三者具有協(xié)同作用關系，對改善序批式厭氧干發(fā)酵條件具有重要的調節(jié)作用。