李銀銀 王 洪 李長(zhǎng)龍 郭 萌 魏 杰張 鈺 黃 韌 陳振文 杜小燕

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)(2.中國(guó)食品藥品檢定院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100050)(3.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510633)

封閉群小鼠在生物醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[1]。國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心負(fù)責(zé)對(duì)國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位提供種源，其動(dòng)物遺傳質(zhì)量關(guān)系到國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量安全，影響巨大。定期對(duì)群體遺傳質(zhì)量實(shí)施監(jiān)測(cè)可為維持群體符合封閉群要求提供可靠信息，為群體保種和繁殖方式提供指導(dǎo)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是近年來出現(xiàn)的第三代遺傳標(biāo)記，由于其具有數(shù)目多、分布廣、遍布整個(gè)基因組及穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，適于對(duì)小鼠遺傳狀況進(jìn)行描述[2]。但在國(guó)內(nèi)報(bào)道中，大多數(shù)研究者選用微衛(wèi)星DNA技術(shù)對(duì)封閉群小鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量分析，而SNP則多用于近交系小鼠的遺傳檢測(cè)[2-4]。本實(shí)驗(yàn)選取45個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)來自國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心北京分中心的ICR(BICR)和上海分中心的ICR(SICR)和KM(SKM)小鼠3個(gè)群體進(jìn)行遺傳分析，以期探討單核苷酸多態(tài)性分析在封閉群小鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用，并與我們前期完成的微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA or short tandem repeat, STR)和生化位點(diǎn)方法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物樣本

選取國(guó)內(nèi)較常用的2個(gè)封閉群小鼠品系的3個(gè)群體，分別是來自國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心北京分中心的ICR群體(BICR)和上海分中心的ICR群體(SICR)及KM種群(SKM)，均為SPF級(jí)。每個(gè)群體隨機(jī)選擇30只小鼠，取0.1 g腎組織于無(wú)菌EP管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)審核(AEEI-2016-187)。

1.2 小鼠基因組DNA的制備

對(duì)EP管中的組織加入2 mL DNA裂解抽提緩沖液，20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，10 μL RNA酶，55 ℃消化過夜，酚氯仿法提取基因組DNA，加入TE緩沖液進(jìn)行溶解。經(jīng)Nanodrop 2000c微量分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度A值在1.8～2.0之間，并經(jīng)1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA質(zhì)檢合格。取原液適量稀釋為50～100ng/μL濃度作為DNA模板，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP位點(diǎn)的選擇

本研究所用45個(gè)SNP位點(diǎn)從相關(guān)文獻(xiàn)中選取[3-5]，位點(diǎn)的選擇盡量均勻分布于小鼠的1～20號(hào)染色體上，較大范圍覆蓋小鼠基因組。

1.4 飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)技術(shù)SNP位點(diǎn)基因分型[6]

1.4.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)：根據(jù)SNP位點(diǎn)查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息，使用Sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay design 3.1設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并進(jìn)行引物合成。PCR體系包括模板DNA1μL，上下游引物(500 nmol/L)各1 μL，dNTP Mix(25 mmol/L)0.1 μL，HotStarTaq DNA 聚合酶(5U/μL)0.1 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.325 μL，PCR Buffer(1.25×)0.625 μL和ddH2O 1.85 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)45次；最后72 ℃持續(xù)3 min。

1.4.2產(chǎn)物堿性磷酸酶處理反應(yīng)：反應(yīng)體系包括0.3 μL蝦堿性磷酸酶(SAP)(1 U/μL)，10×的SAP Buffer 0.17 μL和ddH2O 1.53 μL，將反應(yīng)混合物加入到上一步PCR產(chǎn)物中。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃保溫20 min，85 ℃保溫5 min。

1.4.3單堿基延伸反應(yīng)：將多重PCR反應(yīng)混合物加入上一步SAP酶消化后的產(chǎn)物中。iPLEX反應(yīng)體系為iPLEX酶0.041 μL，iPLEX Buffer Plus 0.2 μL，引物混合液0.94 μL，iPLEX終止混合液0.2 μL和ddH2O 0.619 μL。設(shè)置延伸反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s內(nèi)部循環(huán)5個(gè)，持續(xù)外部循環(huán)40個(gè)。最后72 ℃延伸3 min。

1.4.4MALDI-TOF-MS檢測(cè)：PCR反應(yīng)完成后向產(chǎn)物384孔板中加入16 μL三蒸水，翻轉(zhuǎn)離心機(jī)中室溫旋轉(zhuǎn)混勻30 min，經(jīng)樹脂純化。將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物點(diǎn)在樣品靶上，MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取，根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本各位點(diǎn)基因分型。

1.5 群體遺傳分析

將所有樣本的每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型以AA、BB和AB等形式輸入Popgen 1.32軟件中分析[7]。利用該軟件計(jì)算不同個(gè)體在各SNP位點(diǎn)上的基因頻率、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均雜合度(Ha)及香隆信息指數(shù)等群體遺傳參數(shù)；利用PIC_CALC軟件計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF-MS檢測(cè)

采用MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)3個(gè)小鼠封閉群共90個(gè)樣本進(jìn)行45個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性等位基因分型，并計(jì)算了每個(gè)SNP位點(diǎn)在3個(gè)群體中的等位基因頻率(表1)。從表中可以看出，大多數(shù)SNP位點(diǎn)(27個(gè))在3個(gè)群體中的基因頻率有所不同，但是有6個(gè)SNP位點(diǎn)(rs8271367、rs29492976、rs13466915、rs3089109、rs3023342和rs3091048)在3個(gè)群體中均為單態(tài)，有相同的等位基因型；有8個(gè)位點(diǎn)(rs29778277、rs32390670、rs3089984、rs3023381、rs3091174、rs3023436、rs3023442和rs3089349)在2個(gè)ICR群體中均為純合而且單態(tài)，而在KM群中則存在兩種等位基因型；相反有3個(gè)位點(diǎn)(rs13476538、rs29315008和rs3089205)在KM小鼠群體中呈單態(tài)而在ICR中呈現(xiàn)多態(tài)；另有1個(gè)SNP位點(diǎn)(rs3089604)在ICR和KM群中的等位基因型完全不同。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

封閉群SKM小鼠在45個(gè)SNP位點(diǎn)中，15個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)性位點(diǎn)，30個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)二等位基因型。該小鼠群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)為1.673 9，平均有效等位基因數(shù)為1.376 9，平均雜合度為0.215 2，平均多態(tài)性信息含量為0.166 6。高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5) 有0個(gè)，中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25

而封閉群SICR小鼠在45個(gè)SNP位點(diǎn)中，20個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)性位點(diǎn)，25個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)二等位基因型。該小鼠群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)為1.555 6，平均有效等位基因數(shù)為1.220 9，平均雜合度為0.143 2，平均多態(tài)性信息含量為0.119 9。高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5) 有0個(gè)，中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25

表1 封閉群小鼠3個(gè)群體在45個(gè)SNP位點(diǎn)上的等位基因頻率

注：“*”標(biāo)注為篩選的15個(gè)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的位點(diǎn)；“#”標(biāo)注為篩選的20個(gè)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的位點(diǎn)

Note：“*”means 15 loci used for population genetic structure analysis；“#”means 20 loci used for population structure analysis

表2 封閉群SKM小鼠在45個(gè)SNP位點(diǎn)上的等位基因數(shù)、平均雜合度和多態(tài)性信息含量Table 2 Number of allele, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC)of 45 SNP loci in SKM mice

注：Na：等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；Ho：觀測(cè)雜合度；He：期望雜合度；Ha：平均雜合度；SI：香隆指數(shù)；PIC：多態(tài)性信息含量

Note: Na:Number of allele; Ne:Number of effective allele; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; Ha: Average heterozygosity; SI: Shannon’s index; PIC: Polymorphism information content

而封閉群BICR小鼠在45個(gè)SNP位點(diǎn)中，22個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)性位點(diǎn)，23個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)二等位基因型。該小鼠群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)為1.5111，平均有效等位基因數(shù)為1.2851，平均雜合度為0.1699，平均多態(tài)性信息含量為0.1375。高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5)有0個(gè)，中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

利用Popgen1.32，計(jì)算SKM小鼠45個(gè)SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的P值。結(jié)果有2個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，25個(gè)位點(diǎn)在群體遺傳中處于Hardy-Weinberg遺傳平衡，各位點(diǎn)的P值見表2中所示。同樣計(jì)算SICR、BICR中Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的P值。顯示分別有0和1個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，11和17個(gè)位點(diǎn)在群體遺傳中處于Hardy-Weinberg遺傳平衡。

2.4 SNP位點(diǎn)與微衛(wèi)星DNA和生化位點(diǎn)方法的比較

我們將SNP位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與前期STR和生化位點(diǎn)檢測(cè)同一群體的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，無(wú)論是SNP還是STR位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳檢測(cè)，用雜合度來評(píng)價(jià)三個(gè)群體的遺傳多樣性時(shí)，趨勢(shì)相同，均為SKM >BICR >SICR；而如果以香隆信息指數(shù)(SI)來評(píng)價(jià)時(shí)，SNP的檢測(cè)結(jié)果與雜合度評(píng)價(jià)的趨勢(shì)相同，但STR的結(jié)果卻不同，變?yōu)锽ICR >SICR >SKM。我們進(jìn)行基因頻率排序并去除在群體中單態(tài)的SNP 位點(diǎn)，即用基因頻率相對(duì)高的20和15個(gè)SNP位點(diǎn)計(jì)算群體遺傳參數(shù)時(shí)，各遺傳參數(shù)的絕對(duì)值有所上升，尤其是SI值與STR的檢測(cè)結(jié)果更趨接近(表3)。在對(duì)群體的雜合性和均一性評(píng)價(jià)時(shí)，仍然是SKM群體的多樣性(He)和均一性(SI)均為最好。

表3 同一群體分別用SNP、STR和生化位點(diǎn)檢測(cè)的遺傳參數(shù)比較

注：Na：等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；Ho：觀測(cè)雜合度；He：期望雜合度；Ha：平均雜合度；SI：香隆信息指數(shù)；PIC：多態(tài)性信息含量

Note: Na: Number of allele; Ne: Number of effective allele; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; Ha: Average heterozygosity; SI: Shannon’s index; PIC: Polymorphism information content

3 討論

昆明小鼠(KM)和ICR小鼠，廣泛應(yīng)用于藥物實(shí)驗(yàn)、生物制品及化妝品的鑒定、評(píng)價(jià)和篩選實(shí)驗(yàn)中，是我國(guó)應(yīng)用最廣泛的封閉群小鼠[8]。為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性，需要定期對(duì)KM和ICR小鼠乃至所有封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施遺傳質(zhì)量檢測(cè)[9]，來監(jiān)測(cè)其遺傳穩(wěn)定性[10]。單核苷酸多態(tài)性作為第三代遺傳標(biāo)記物在小鼠近交系遺傳研究中已經(jīng)得到應(yīng)用，國(guó)內(nèi)有多位研究者采用SNP對(duì)常用近交系小鼠的遺傳質(zhì)量狀況進(jìn)行了分析，表明SNP可用于小鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)[3, 11-12]。MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)具有分析速度快、準(zhǔn)確、分辨率高、自動(dòng)化、靈敏等特點(diǎn)，已經(jīng)成為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸分子的技術(shù)，是一種理想的SNP檢測(cè)方法。因此本研究選取45個(gè)SNP位點(diǎn)，運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)來自上海、北京的3個(gè)封閉群小鼠遺傳狀況分析，來探索SNP在封閉群小鼠遺傳質(zhì)量狀況分析中的應(yīng)用。

本研究選取位于小鼠1～20號(hào)染色體上的45個(gè)SNP位點(diǎn)，保證標(biāo)記物對(duì)基因組的代表性及研究結(jié)果的可靠性。從我們的結(jié)果可知(表1)，在3個(gè)群體中45個(gè)位點(diǎn)的基因頻率顯示，僅在KM小鼠群體中呈單態(tài)的位點(diǎn)有3個(gè)，相反僅在ICR小鼠群體中呈單態(tài)的位點(diǎn)有8個(gè)，此外，雖然rs3089604位點(diǎn)在ICR和KM群體都呈現(xiàn)單態(tài)，但基因型則完全不同。所以我們認(rèn)為可以參考以上位點(diǎn)在兩種群體中的等位基因頻率的不同對(duì)ICR和KM小鼠群體進(jìn)行辨別，即這些位點(diǎn)有可能作為ICR和KM兩個(gè)品系的鑒定依據(jù)，這對(duì)于同為白色小鼠的KM和ICR非常有意義。

有效等位基因數(shù)和期望雜合度是反映群體遺傳變異大小的指標(biāo)。但由于SNP是二等位基因型，所以其有效等位基因數(shù)偏低，但也在一定程度上反映群體中等位基因的分布情況。本實(shí)驗(yàn)中3個(gè)封閉群中平均觀測(cè)等位基因數(shù)分別為SKM 1.6739、SICR 1.5556和BICR 1.5111，群體觀測(cè)等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)有偏差，說明所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的等位基因在群體基因組中的分布還不夠均勻[7]。有多個(gè)遺傳標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為一個(gè)較好的封閉群其平均雜合度在0.5～0.7之間，而本實(shí)驗(yàn)中SKM、SICR和BICR小鼠群體平均雜合度絕對(duì)數(shù)值偏低，用15個(gè)SNP計(jì)算后雖然數(shù)值有所升高，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到0.5。究其原因一方面可能是我們選的部分位點(diǎn)在兩個(gè)封閉群中為單態(tài)；另一方面也可能是由于遺傳標(biāo)記本身的性質(zhì)決定，STR本身就是多等位基因的，有時(shí)候一個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)能達(dá)到十幾甚至幾十個(gè)[13]，而SNP只有兩個(gè)等位基因，這說明用不同的遺傳標(biāo)記檢測(cè)封閉群時(shí)可能不應(yīng)以雜合度的絕對(duì)值作為其雜合性和多樣性的判定標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，進(jìn)行3個(gè)群體平均雜合度比較時(shí)，SNP位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與STR的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致，即SKM>BICR>SICR，從等位基因數(shù)和平均雜合度角度可以認(rèn)為SKM小鼠的遺傳多樣性高于北京和上海的ICR小鼠群體。但是我們發(fā)現(xiàn)，用香隆信息指數(shù)(SI)來評(píng)價(jià)時(shí)，SNP的檢測(cè)結(jié)果與等位基因數(shù)和平均雜合度判斷的趨勢(shì)相同，而STR的結(jié)果卻不盡相同。我們知道，SI代表了等位基因在群體內(nèi)個(gè)體分配的均勻性，這可能說明所選SNP和STR位點(diǎn)在KM和ICR兩個(gè)群體中的均勻性不同。

總之，本研究表明在封閉群小鼠遺傳狀況的分析中，SNP可以作為一項(xiàng)遺傳標(biāo)記來反應(yīng)其遺傳狀況，而且有些SNP位點(diǎn)可能具有進(jìn)行封閉群小鼠品系鑒定的潛在應(yīng)用前景。另外本研究所選的位點(diǎn)中有部分位點(diǎn)屬于單態(tài)性，在群體遺傳中可以適當(dāng)舍棄，有必要開發(fā)更多的SNP位點(diǎn)及群體分析擴(kuò)展SNP在小鼠封閉群中的應(yīng)用前景。