殷婷婷

（齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

1 油菜多倍體誘導(dǎo)技術(shù)概述

油菜是十字花科植物，顏色深綠，一年生草本，直根系，莖直立，分枝較少，株高30～90 cm，葉互生，分基生葉和莖生葉兩種。多倍體育種已在觀賞花卉和蔬菜作物上得到廣泛應(yīng)用，如多倍體蔬菜常見的有無籽西瓜、黃瓜、白菜、辣椒等，多倍體花卉中常見有矮牽牛、君子蘭、紫茉莉等[1]。油菜作為主要的油料作物，其經(jīng)濟(jì)價值和觀賞價值都很高。因此，油菜的多倍體的誘導(dǎo)具有重要的意義。

多倍體植株一般具有植株粗壯、葉片肥大、花器官大、花色嬌艷、耐儲藏運輸[2]；生長勢強(qiáng)、分枝減少、生育期延長；種子增大、結(jié)實率降低；氨基酸、還原糖、維生素及礦物質(zhì)含量增加；有機(jī)營養(yǎng)成分增多等優(yōu)點[3]，因此,研究多倍體誘導(dǎo)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中具有重要意義。自然界中獲得多倍體的過程很漫長，為此常用人工誘導(dǎo)的方法獲得多倍體植株，分為化學(xué)方法和物理方法。物理方法包括各種射線、溫度異變、調(diào)整離心力、機(jī)械創(chuàng)傷等，其誘變效率太低，重復(fù)性差，很難在實踐中得到應(yīng)用，因而在多倍體的誘導(dǎo)研究中往往采用化學(xué)方法，誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)藥品有很多，主要有秋水仙素、氯乙醛、笑氣、富民等，其中秋水仙素被廣泛采用[2]。秋水仙素是微管特異性藥物，主要作用是抑制細(xì)胞分裂時紡錘體的形成，阻止染色體移向兩級移動，停留在分裂中期，細(xì)胞不能繼續(xù)分裂，從而產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)分裂，產(chǎn)生多倍體植株[4]。

秋水仙素對不同植物的作用存在差異，有研究表明，一般秋水仙素的有效濃度在0.01%～0.4%，而以0.2%左右的濃度為最常用。在實際應(yīng)用中，0.2%的濃度常設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)濃度，向上或向下篩選合適的濃度。利用秋水仙素處理材料的時間一般大于24 h，據(jù)報道處理時間一般為2～6 d，但濃度很低時處理時間有的會長達(dá)30 d?？傊?，處理濃度高時，處理時間可能會相應(yīng)縮短；反之，處理時間會相應(yīng)延長。處理溫度一般為18～25℃，此溫度下細(xì)胞分裂與植物生長旺盛，處理效果較好[5]。

秋水仙素處理材料的方法有：浸漬法、滴液法、涂抹法、注射法。其中浸漬法簡單易行，便于操作，誘導(dǎo)效率高[6]。運用秋水仙素溶液直接浸泡種子的方法已成功的在菊花腦、小白菜、君子蘭[7-9]等植物上誘導(dǎo)出了多倍體。借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗即采用了浸種法并期望獲得多倍體植株，以期為下一步多倍體植物育種奠定一定的研究基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料及試劑 試驗用材料為市售的油菜種子，秋水仙素、無水乙醇、冰醋酸、卡諾氏固定液、5 mol/L鹽酸、45%醋酸、1%龍膽紫以及Hoagland營養(yǎng)液。

2.2 油菜種子處理 本試驗采用浸種法，選取籽粒飽滿的油菜種子。先用蒸餾水浸泡12 h，催根、芽萌動后倒掉水分，種子用0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的秋水仙素溶液分別進(jìn)行12 h、24 h、48 h浸泡處理(浸沒種子的2/3)，由于秋水仙素溶液見光易分解，因此在處理時放置黑暗處。另有一組為對照組，浸在蒸餾水中處理相同時間。藥物處理結(jié)束后，取出種子，用蒸餾水沖洗種子及根2～3次去除殘留的秋水仙素。將萌發(fā)種子移到裝有Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中25 ℃光照培養(yǎng)，每天光照14 h，培養(yǎng)發(fā)芽。根尖長到1～2 cm，選取健壯根尖將根尖固定后保存于70%乙醇中，用于觀察染色體加倍情況。

2.3 形態(tài)變異率統(tǒng)計 5 d后，以根莖部位明顯變短、膨大作為形態(tài)變異指標(biāo)，統(tǒng)計變異株占總苗數(shù)的百分率。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察 7 d后，測定各實驗組植株的株高，每組隨機(jī)選取10株健壯的植株進(jìn)行株高測量。其中，株高為自植株基部到頂端的自然高度。取對照和多倍體植株葉片的同一部位觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的變化。

2.5 細(xì)胞學(xué)觀察 取出早期保存于70%乙醇中的根尖，投入卡諾氏固定液（現(xiàn)用現(xiàn)配）中固定(30 min)，將固定好的根尖用蒸餾水沖洗2次放入5 mol/L鹽酸中處理5～10 min，當(dāng)根尖的伸長區(qū)變透明而分生區(qū)呈乳白色時即可取出。將解離好的材料用蒸餾水沖洗后，轉(zhuǎn)入45%醋酸中軟化10 min。將軟化好的根尖放在載玻片上，用刀片切去伸長區(qū)，只留下1～2 mm的分生區(qū)。滴1滴龍膽紫染色液染色3～5 min。染色完畢后用吸水紙吸去多余的染液并用蒸餾水沖洗，然后將材料移至另一清潔的載玻片上，覆以蓋玻片，以鉛筆的橡皮頭端輕輕敲打蓋玻片，使材料呈現(xiàn)分散的薄層，置光學(xué)顯微鏡（1 000倍）下觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 秋水仙素對油菜的誘變效應(yīng) 以植株根莖部粗大作為形態(tài)變異指標(biāo)，由表1可知，秋水仙素濃度相同時，隨著處理時間的延長，死亡率隨之增高，說明處理時間越長，秋水仙素對種子的毒害就越大。處理時間相同時，隨著處理濃度的變大，死亡率隨之增高，表明處理濃度越大，秋水仙素對種子的毒害也越大。由誘變率可知，雖然0.4%的濃度處理油菜48 h變異率為86.7%，但由于死亡率為63.3%遠(yuǎn)大于0.2%的濃度處理24 h的13.3%，效果欠佳。因此，油菜以0.2%秋水仙素處理24 h誘導(dǎo)效果最佳，誘變率為63.3%。

表1 不同濃度秋水仙素和處理時間對油菜的誘導(dǎo)效果

3.2 秋水仙素對油菜株高的影響 對照播種后第2 d開始出苗，而且出苗一致，到第3 d大致出齊，而經(jīng)秋水仙素處理過的種子出苗則相應(yīng)延遲，生長速度明顯遲緩，根部粗短，莖增粗，子葉加厚，葉片濃綠且發(fā)亮，葉片皺縮。說明經(jīng)秋水仙素對萌動中的種子有一定的毒害作用（如圖1所示）。

由圖1可以看出，同一濃度的秋水仙素隨著處理時間的延長對油菜株高的抑制作用越來越明顯。同一處理時間相同的情況下，株高隨著秋水仙素濃度的遞增呈現(xiàn)一個下降的趨勢，說明無論是低濃度還是高濃度的秋水仙素對株高均呈現(xiàn)抑制作用。

3.3 油菜多倍體鑒定 在光學(xué)顯微鏡（1 000倍）下觀察對照及變異油菜葉片的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞，結(jié)果顯示加倍后的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞明顯變大（圖2，a、b）。采用根尖壓片對變異植株和二倍體植株分別進(jìn)行染色體鑒定。光學(xué)顯微鏡（1 000倍）下觀察，可見與對照植株相比，變異植株染色體數(shù)明顯加倍（圖2，c、d）。

圖1 不同秋水仙素濃度和處理時間對油菜株高的影響

圖2 二倍體與多倍體的染色體和氣孔比較（a、c：二倍體；b、d：多倍體）

4 討論與結(jié)論

多倍體育種中秋水仙素仍然是應(yīng)用最廣泛的化學(xué)試劑之一，研究表明，多倍體誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因素是把握好秋水仙素的濃度以及處理時間。濃度過低以及處理時間過短都難以取得理想的誘變效果，而高濃度的秋水仙素或處理的時間過長都會對種子產(chǎn)生毒害作用[10]。通過秋水仙素誘導(dǎo)獲得的油菜變異株：植株粗壯，葉片增厚，葉片深綠，保衛(wèi)細(xì)胞增大，植物生長速度緩慢，這些表現(xiàn)基本同一般多倍體變異一致[11]。因此，在多倍體誘導(dǎo)過程中，可以將形態(tài)及氣孔特征的變異作為篩選多倍體的初步鑒定指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上通過染色體的鑒定進(jìn)一步確定變異植株，這樣可以簡化操作過程，縮短工作時間。本試驗采用了秋水仙素溶液浸泡種子法，研究了不同濃度相同處理時間對植物倍性的影響，并通過形態(tài)觀察、氣孔觀察、染色體鑒定方法對多倍體的初步特征進(jìn)行了研究。試驗得出誘導(dǎo)油菜的最佳組合是0.2%秋水仙素處理24 h。此研究結(jié)果對下一步多倍體油菜育種奠定了一定的研究基礎(chǔ)。