謝雙德 魏姍姍 張華年 王桂松 彭學標 趙 珂 李俊灝 賴 寬

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種多發(fā)于青年女性的可累及全身多臟器的自身免疫性疾病，其特點是血清中存在以抗核抗體、抗ds-DNA抗體為代表的多種自身抗體。發(fā)病機制主要為T、B淋巴細胞功能異常引起機體免疫功能紊亂，產(chǎn)生大量自身抗體。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路通過自噬調(diào)控、氧化應激、免疫調(diào)節(jié)參與SLE的發(fā)病過程。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種不同的復合物，mTORC1激活后通過磷酸化下游靶點(p70S6激酶)參與調(diào)控mRNA翻譯[1]。激活的mTOR通路是SLE患者出現(xiàn)T、B淋巴細胞異?；罨年P鍵因素[2]。Th17淋巴細胞亞群在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，活動期 SLE 患者外周血中 Th17 淋巴細胞比例升高，產(chǎn)生 IL-17 能力增強[3]。有研究表明：在類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性硬皮病、干燥綜合征和SLE等自身免疫性疾病中，mTOR通路與Th17淋巴細胞亞群關系密切。為了探討mTORC1信號通路及Th17淋巴細胞亞群在狼瘡鼠發(fā)病中的作用及相關性，我們對狼瘡鼠體內(nèi)mTORC1信號通路及Th17淋巴細胞亞群進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 實驗組選用6只B6.MRL/lpr狼瘡小鼠，20周齡，質(zhì)量25～30 g，購于南京大學模式動物研究所。對照組選用6只正常C57小鼠，20周齡，質(zhì)量25～30 g，購于南方醫(yī)科大學動物中心。

1.2 主要試劑 小鼠IL-17 ELISA試劑盒(武漢六合生物技術有限公司)、RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)兔抗鼠mTOR單克隆抗體、兔抗鼠p-mTOR(2448)單克隆抗體、兔抗鼠p70S6K單克隆抗體、兔抗鼠p-p70S6K單克隆抗體(均是美國CST公司)、羊抗鼠IL-17抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)、鼠抗鼠AKT單克隆抗體(Proteintech公司)、Western制膠試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本制備 將兩組小鼠麻醉取血處死后，腹部正中線切開，切取脾臟冰上放置，用于制備淋巴細胞單細胞懸液；切取小鼠的腎臟用于mRNA和蛋白水平測定。

1.3.2 流式細胞分析儀檢測Th17(CD4+IL-17+T)細胞 無菌條件下制備小鼠脾臟淋巴細胞單細胞懸液[要求細胞濃度為(0.5～1)×107/mL]；加入Cell Stimulation Cocktail(eBioscience, San Jose, USA)，用Staining buffer(eBioscience)洗滌；加入CD4抗體，4℃避光孵育30 min，Staining buffer(eBioscience)洗滌；加入FIX工作液，渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，Permeabilization Buffer (eBioscience)洗滌；加入IL-17A抗體，4℃避光孵育30 min，Permeabilization Buffer (eBioscience)洗滌；200 μL Staining buffer(eBioscience)重懸細胞，BDcalibur(eBioscience)流式細胞儀上機檢測。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測小鼠腎臟Akt、mTOR、p70S6K和IL-17的mRNA表達 用Trizol(Life Technologies)一步法提取50 mg小鼠腎臟的總mRNA，超微量分光光度計稀釋RNA濃度并定量到1 μg/μL，反向轉錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green(Takara)進行實時熒光PCR反應；反應參數(shù)：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。實驗所用的引物如表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting檢測小鼠腎臟Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白表達 稱量小鼠腎臟50 mg，剪碎后加入500 μL冷Lysis Buffer(含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、PMSF，凱基生物有限公司)，勻漿，離心后得蛋白提取物；采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度；6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，蛋白分離后小分子200 mA、大分子350 mA轉膜至PVDF膜上。室溫下5%脫脂奶粉封閉膜2 h，用含5%BSA稀釋的一抗4℃孵育膜過夜，洗滌后用含5% BSA稀釋的HRP偶聯(lián)的二抗(1∶1000)室溫孵育2 h。洗滌后發(fā)光預覽；調(diào)節(jié)曝光時間；調(diào)整圖片并輸出。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，應用SPSS20.0軟件處理，采用獨立樣本t檢驗，或者單因素方差分析。RT-PCR數(shù)據(jù)進行2-△△CT計算得到(△CT值=目標基因CT值-內(nèi)參基因CT值；△△CT值=實驗組△CT值-對照組△CT值)轉換后數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞分析儀檢測小鼠脾臟Th17淋巴細胞亞群 狼瘡鼠組的Th17細胞占CD4+T細胞的比例[Th17/CD4+T，(10.89±1.69)%]顯著高于正常對照組的(2.56±0.36)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組小鼠脾臟Th17淋巴細胞亞群的比例

2.2 RT-PCR檢測腎臟組織Akt、mTOR、p70S6k、IL-17 mRNA表達 與對照組相比，狼瘡鼠組Akt、mTOR、p70S6K、IL-17的mRNA表達水平[Akt：3.31±1.03%、mTOR:(3.59±0.46)%、p70S6K:(1.98±0.41)%、IL-17:(8.15±1.26)%]均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組小鼠腎臟Akt、mTOR、p70S6K、IL-17mRNA的表達情況

2.3 Western blot檢測腎臟組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達 根據(jù)狼瘡鼠腎臟提取的組織蛋白進行Western blot檢測，檢測到Akt、mTOR、p70S6K反應條帶分別位于56、289、70 ku處，內(nèi)參β-actin反應條帶位于43 ku處，與預期結果相同。與對照組相比，狼瘡鼠組的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白條帶著色較深。見圖3。

圖3 兩組小鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達

3 討論

CD4+T細胞可被誘導分化為Th1、Th2、Th17、Treg細胞，Th17細胞是由Park等[4]發(fā)現(xiàn)的新的T細胞亞群，以選擇性分泌IL-17為特征，在類風濕性關節(jié)炎、自身免疫性炎性腸病、系統(tǒng)性硬皮病及SLE等自身免疫病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用；Yang等[3]研究顯示，活動期SLE患者外周血中Th17淋巴細胞比例升高，產(chǎn)生 IL-17 能力增強。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)：狼瘡鼠動物模型腎臟組織RORγt、IL-17mRNA表達量較正常小鼠增多[5](RORγt是調(diào)控Th17細胞分化及IL-17分泌的關鍵性轉錄因子[6])。在本次實驗中，狼瘡鼠動物模型Th17細胞占CD4+T細胞的比例及腎臟組織中IL-17mRNA表達量均高于正常小鼠，與前期實驗結果及相關人體實驗的結果相一致，進一步證實Th17、IL-17在SLE發(fā)病中的致病作用。

mTOR是存在于真核細胞中的一類絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，以兩種不同形式的復合物存在：mTORC1和mTORC2。其中，mTORC1主要與細胞的營養(yǎng)、能量和細胞因子等信號相關，促進細胞增殖或自噬。mTORC1可被多種途徑所激活，如營養(yǎng)物質(zhì)[7](氨基酸、葡萄糖)、生長因子(胰島素)、氧化還原作用等[8]。mTORC1被激活后可通過不同途徑調(diào)控核糖體生成和mRNA轉錄,促進糖酵解、磷酸戊糖途徑及脂類合成等相關基因的轉錄[9]。PI13K/Akt是mTORC1激活的重要途徑，Akt及其在Thr308位點的磷酸化是PI13K/Akt通路的重要激活位點[10]。研究表明：mTORC1通過磷酸化核糖體S6激酶(S6K1，p70S6K)，或真核起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)促進轉錄，調(diào)控蛋白質(zhì)的合成[11]。

在CD4+T細胞中，mTORC1可以增加Th17淋巴細胞亞群分化，抑制mTORC1可以增加Treg細胞的分化[12]，在Rheb或Raptor基因刪除導致的mTORC1缺失中，Th17淋巴細胞亞群的分化也受到損害[13,14]。mTORC1主要通過以下幾種方式調(diào)節(jié)Th17淋巴細胞亞群：1)mTORC1激活下游的HIF-1α，HIF-1α可以通過增加Rorc和Th17淋巴細胞亞群相關的基因表達，增加快速T細胞擴增所需要的糖酵解活性從而調(diào)節(jié)Th17淋巴細胞亞群的分化[15-17]；2)mTOR通過磷酸化STAT從而調(diào)節(jié)Th17淋巴細胞亞群分化[14]；3)mTORC1抑制劑通過減少RORγt的核易位和增加Gfi1表達來抑制Th17淋巴細胞亞群分化[18]。

本實驗通過RT-PCR及Western blot 檢測各組小鼠腎臟mTORC1信號通路相關基因和蛋白的表達，通過流式細胞技術檢測小鼠脾臟Th17/CD4+T比例。與正常對照組相比，狼瘡鼠組mTOR、p70S6K、Akt及其磷酸化水平顯著升高，Th17/CD4+T比例升高，提示mTORC1信號通路在狼瘡鼠體內(nèi)被激活，進而促進Th17淋巴細胞亞群分化，在SLE的發(fā)病中起著重要作用。該結論可能為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療提供新的思路和靶點。