何碩康 羅澤偉

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物統(tǒng)計(jì)所，上海 200433）

多倍化（Polyploidy）即生物體合子中擁有超過兩套染色體的現(xiàn)象，廣泛存在于自然界中，如魚類［1］、甲殼類［2］以及兩棲類［3］。植物中多倍化現(xiàn)象更是普遍存在。80%以上的被子植物在進(jìn)化過程中存在多倍性［4］。以多倍體形式存在的物種有更豐富的基因型與表型多態(tài)性，進(jìn)而提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性與群體遺傳多態(tài)性［5］。此外，多倍化也是產(chǎn)生與保持雜種優(yōu)勢(shì)的重要途徑之一［6］。根據(jù)多倍體中染色體組的遺傳來源，可將多倍體分為同源多倍體（Autopolyploid）與異源多倍體（Allopolyploid）［7］。

多倍化會(huì)對(duì)細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生深刻的影響［8］。在多倍體減數(shù)分裂過程中，既有可能染色體之間兩兩交叉形成二價(jià)體，染色體行為類似于二倍體，這種模式被稱為二體遺傳；也有可能超過兩條同源染色體或近源染色體之間交叉形成多價(jià)體，這種模式被稱為多體遺傳，這導(dǎo)致多倍體遺傳要比二倍體遺傳復(fù)雜很多［9］。目前對(duì)于多倍體遺傳的研究都是建立在群體數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上。即利用兩套背景不同、具有多態(tài)性標(biāo)簽位點(diǎn)的染色體構(gòu)建雜合同源或異源多倍體親本，然后對(duì)其后代回交或自交群體采集一定大小的樣本，進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)并繪制圖譜，統(tǒng)計(jì)分析［10］。實(shí)際上，群體數(shù)據(jù)的分析是極其依賴模型的，依據(jù)的模型不同所得結(jié)果常有較大差異［11，12］。但目前多是利用理論分析與計(jì)算機(jī)模擬的方法建模，而沒有一個(gè)由準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的模型。因此我們希望利用四分子分析，這一能夠精準(zhǔn)分析單次減數(shù)分裂的方法［13］，將多倍體遺傳重組的研究從群體水平精確到個(gè)體水平，構(gòu)建有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的多倍體遺傳重組模型。20世紀(jì)90年代以來，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因［14，15］，這3個(gè)基因任意一個(gè)的純合失活突變都能使花粉母細(xì)胞單次減數(shù)分裂發(fā)育而來的4個(gè)花粉互不分離，并由此將這3個(gè)基因命名為QUARTET（QRT1、QRT2以及QRT3），是應(yīng)用四分子分析的極好材料。因此本研究從帶有qrt1突變的二倍體擬南芥Columbia及Landsberg erecta生態(tài)型出發(fā)，誘導(dǎo)并篩選染色體組成功加倍的四倍體qrt1突變株，并測(cè)定它們與二倍體及四倍體參照的表型差異，能為在多倍體遺傳重組中應(yīng)用四分子分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型Columbia生態(tài)型二倍體Col-0及其四倍體CS3151、野生型Landsberg erecta生態(tài)型二倍體Ler及其四倍體CS3900均為實(shí)驗(yàn)室保存。二倍體Columbia QRT1 -/- 突變體、二倍體Landsberg erecta QRT1 -/- 突變體以及特異性識(shí)別 擬南芥（Arabidopsis thaliana）著絲粒位置180 bp重復(fù)序列的熒光原位雜交探針獲贈(zèng)于陸平利研究員（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院植物科學(xué)研究所）。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的誘導(dǎo)與傳代 用0.08%濃度的秋水仙素溶液處理10 d齡的QRT1 -/- 二倍體Columbia與Landsberg erecta幼苗（G0）5 h。培養(yǎng)G0幼苗，收集G0的種子。將這批種子種下，從這批苗（G1）中鑒定與篩選成功加倍的植株，收集這些植株的種子，傳代，并于后代中再次驗(yàn)證倍性。

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù) 取50 mg左右植株幼嫩蓮座葉片，參照文獻(xiàn)［16］處理。不同的是，這里葉片材料經(jīng)過破碎之后經(jīng)過30 μm孔徑尼龍膜過濾，并用100 μg/mL的碘化丙啶（PI）染色30 min左右。所用儀器為FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD Biosciences），分析軟件為CellQuestPro。所用熒光染料為PI，選擇熒光檢測(cè)通道為FL2，同時(shí)對(duì)FL-2的值取對(duì)數(shù)，使等比DNA含量的峰在圖上顯示為等間距的峰。

1.2.3 熒光原位雜交技術(shù) 取卡諾氏液固定好的幼嫩花序，按照前人方式［17］處理，觀察其中花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂。DNA染料為4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），同時(shí)利用特異性識(shí)別擬南芥著絲粒位置180 bp重復(fù)序列的熒光原位雜交探針標(biāo)識(shí)著絲粒的位置，進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。熒光探針生色基團(tuán)為Cy3，識(shí)別序列以及制作過程參照文獻(xiàn)進(jìn)行［18］。

2 結(jié)果

2.1 四倍體的誘導(dǎo)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)倍性結(jié)果

本研究中，為確定細(xì)胞倍性，利用流式細(xì)胞技術(shù)，以二倍體野生型Col與Ler（圖1-A，1-B）、四倍體野生型Col與Ler（圖1-G，1-H）為對(duì)照，從Columbia背景篩選出并編號(hào)為C313的植株（圖1-C），從Ler背景篩選出并編號(hào)為L311的植株（圖1-D）。自交傳代，并在G3中再次用流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證C313與L311的倍性（圖1-E，1-F）。

本研究中的流式結(jié)果，顯示了擬南芥中廣泛存在的內(nèi)復(fù)制現(xiàn)象［19］，即核基因組復(fù)制而細(xì)胞不分裂的現(xiàn)象。這導(dǎo)致擬南芥葉片實(shí)際為多種倍性細(xì)胞共存的嵌合體，故其流式結(jié)果中有多個(gè)峰。而由于熒光強(qiáng)度取了對(duì)數(shù)，故等比的峰表現(xiàn)為等間距的峰。而二倍體與四倍體的區(qū)別就在于，二倍體有2n的峰（圖1-A，1-B），而四倍體沒有（圖1-G，1-H）。經(jīng)過G1與G3的重復(fù)驗(yàn)證，流式結(jié)果驗(yàn)證C313與L311核基因組加倍成功。另外，有文章［20］報(bào)道擬南芥的內(nèi)復(fù)制速率隨著倍性的提高而提高，在本研究中，也基本反映了這一現(xiàn)象（圖1-C，1-E，1-F，1-G，1-H），在這幾張圖中，4n的峰相比于二倍體中2n的峰（圖1-A，1-B）要更低，而內(nèi)復(fù)制之后的峰相對(duì)的更高，表現(xiàn)出更高的內(nèi)復(fù)制速率。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞倍性

2.2 熒光原位雜交技術(shù)鑒定倍性結(jié)果

在利用流式初步在G1群體中篩選出C313與L311植株后，于花期觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂（圖2-d-i）。在細(xì)線期，細(xì)胞已完成DNA復(fù)制，染色體開始凝聚。此時(shí)姐妹染色單體通過著絲粒相連，尚未分開。而同源染色體尚未配對(duì)。因此染色質(zhì)彌散于核內(nèi)，每一個(gè)著絲粒都代表一條染色體，代表其上的一對(duì)姐妹染色單體?？梢奀313與L311中皆能數(shù)到20個(gè)點(diǎn)，而二倍體對(duì)照（圖2-a-c）只能數(shù)到10個(gè)點(diǎn)，驗(yàn)證了倍性。并繼續(xù)傳代，至G3時(shí)，再次觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂（圖2-j-p），驗(yàn)證了C313與L311染色體加倍成功。

圖2 熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞倍性

2.3 營養(yǎng)生長相關(guān)表型的測(cè)定與分析

2.3.1 倍性對(duì)主根及側(cè)根生長的影響 利用垂直平板培養(yǎng)記錄種子萌發(fā)期根的生長，包括縱向深度（主根長度）和橫向廣度（測(cè)根數(shù)目）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Col與Ler背景中，多倍化都不對(duì)主根的生長造成影響，而qrt1突變?cè)贚er中對(duì)主根生長有抑制作用（圖3-A-C），p=2.2e-16）。至于側(cè)根，多倍化以及qrt1突變?cè)趦蓚€(gè)被背景中都會(huì)抑制側(cè)根數(shù)目，而在Ler中，多倍化及qrt1突變的抑制作用顯現(xiàn)出一定的可加性，而在Col中則沒有（圖3-D，E）。

圖3 根的相關(guān)表型

2.3.2 倍性對(duì)莖的影響 與一般多倍化導(dǎo)致植株體型增大的報(bào)道不同，本研究中發(fā)現(xiàn)倍性對(duì)主莖高度的影響具有背景依賴性（圖4-C）），即在Col中，四倍體更高（37.72 cm增長至41.41 cm，p=2.06e-17），而在Ler中，四倍體更矮（33.52 cm降低至31.56 cm，p=2.50e-10），也許是由于樣本量（30株）不夠大導(dǎo)致的。同時(shí)，四倍體中主莖抽薹日期也被推遲（圖4-D），Col中由26.2 d推遲至39.0 d，Ler中由24.6 d推遲至35.0 d）。至于分枝，我們又分了兩個(gè)表型，一個(gè)是近蓮座的基部側(cè)枝（類似于分蘗），一個(gè)是距離土壤有一定高度的主莖分枝。多倍化僅僅在Ler背景中抑制了主莖分枝的數(shù)量，在Col背景中則無影響（圖4-B）。而對(duì)于基部側(cè)枝這個(gè)表型，不管是多倍化還是qrt1突變，都具有顯著的抑制效果，同時(shí)二者抑制作用可疊加（圖4-A）。實(shí)際上，在四倍體主莖基部，可以觀察到未生長的芽，所以四倍化抑制基部側(cè)枝數(shù)目主要是通過抑制芽的生長而不是芽的發(fā)生。

2.3.3 倍性促進(jìn)葉的初生生長 至于對(duì)葉的影響，在兩個(gè)背景中，多倍化都導(dǎo)致蓮座葉片面積更大，同時(shí)qrt1突變都抑制了葉片面積（圖4-E）。

2.4 生殖生長相關(guān)表型的測(cè)定與分析

首先對(duì)花藥進(jìn)行亞歷山大紅染色（圖5-A），所有的花粉都被染上了紅色，說明多倍化或者qrt1突變都不會(huì)影響花粉的活性。其次，我們測(cè)量了花粉（圖5-B）以及花藥中隔（圖5-C）的大小，發(fā)現(xiàn)多倍化都使其體積增大。至于果莢，多倍化導(dǎo)致每果莢種子數(shù)顯著降低（二倍體Col平均每果莢50.49粒，四倍體Col平均每果莢30.18粒；二倍體Ler平均每果莢40.99粒，四倍體Ler平均每果莢18.84粒）。

本研究中新制四倍體C313與L311相比四倍體參照，每果莢種子數(shù)又進(jìn)一步顯著性的降低（圖5-D），3151平均每果莢32.37粒，C313平均每果莢27.98粒，3900平均每果莢20.28粒，L311平均每果莢17.40粒）。多倍化對(duì)果莢長度的影響具有背景依賴性（圖5-E），在Col中沒有影響，而在Ler中使果莢長度顯著降低（p=2.29e-68）。

多倍化對(duì)每株果莢個(gè)數(shù)的影響同樣具有背景依賴性（圖5-F），但并不是依賴其是Col還是Ler，而是依賴于qrt1突變與否。在二倍體中，qrt1突變使果莢數(shù)顯著降低。在此基礎(chǔ)上，多倍化使野生型果莢數(shù)降低，使qrt1突變體果莢數(shù)上升。

圖4 莖及葉的相關(guān)表型

圖5 花以及果莢相關(guān)表型

在對(duì)種子影響上，四倍化使種子顯著增大（圖6-A）。大小，即種子的長軸長與短軸長，形狀，即種子的離心率。四倍化導(dǎo)致種子的長軸與短軸同時(shí)增大，并最終保持種子的離心率，即形狀基本不變（圖6-B-D）。當(dāng)然Col與Ler，不同背景之間，種子的形狀就有差異，Col種子離心率更大，種子更扁。同時(shí)，加倍之前，種子長軸基本一致，而加倍之后，短軸基本一致（圖6-C-D）。在種子的發(fā)芽率方面，8個(gè)背景種子的發(fā)芽率都接近100%（圖6-F），可見雖然多倍化導(dǎo)致每果莢種子數(shù)大幅降低，但結(jié)出的種子都仍然保持著很好的發(fā)芽率。

圖6 種子相關(guān)表型

3 討論

四分子分析是研究遺傳重組的一項(xiàng)強(qiáng)有力的手段，但一直以來，由于高等真核生物中沒有適合應(yīng)用四分子分析的物理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致這種實(shí)驗(yàn)手段無法被應(yīng)用于真核生物減數(shù)分裂的研究。但隨著QUARTET基因被發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中應(yīng)用四分子分析成為了可能。陸平利教授［21］應(yīng)用四分子分析成功分析了二倍體Col qrt與Ler qrt雜交后代的遺傳重組。

在本研究中，首先從帶有QUARTET1突變的二倍體Columbia與Landsberg erecta生態(tài)型擬南芥出發(fā)，利用秋水仙素誘導(dǎo)體細(xì)胞突變，并從嵌合體植株的后代中，利用流式細(xì)胞儀與熒光原位雜交技術(shù)，通過對(duì)兩個(gè)傳代群體之間的縱向重復(fù)以及群體內(nèi)部的橫向重復(fù)，篩選出成功加倍的帶有qrt1突變的四倍體Columbia與Landsberg erecta生態(tài)型擬南芥C313與L311。為后續(xù)構(gòu)建Col與Ler的雜交分離四倍體群體，并應(yīng)用四分子分析研究多倍體遺傳重組準(zhǔn)備了材料。其次，對(duì)篩選出的Col與Ler同源四倍體的根、莖、葉、花、果莢、種子等表型進(jìn)行了測(cè)定并與相對(duì)應(yīng)的二倍體、四倍體Col、Ler參照進(jìn)行了比對(duì)。在前人對(duì)QUARTET1表達(dá)定位研究的基礎(chǔ)上［22］，通過垂直培養(yǎng)幼苗，統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)目，計(jì)算葉片面積，進(jìn)一步確認(rèn)了qrt1突變抑制了側(cè)根生長以及葉的初生生長。本研究在Columbia與Landsberg erecta兩個(gè)生態(tài)型中。既觀察到了被廣泛闡述的四倍化對(duì)營養(yǎng)生長、生殖生長的促進(jìn)作用，如蓮座葉片、花粉、花藥、種子在四倍化的影響下明顯增大；也發(fā)現(xiàn)了四倍化對(duì)某些器官的抑制效應(yīng)，如側(cè)根數(shù)量、基部側(cè)枝數(shù)量、抽薹日期受到了四倍化的抑制；另外，還發(fā)現(xiàn)有些表型并未受到四倍化的影響，如主根長度、種子形狀。上述這些表型在兩個(gè)生態(tài)型背景中受到四倍化影響是相似的，同為促進(jìn)或同為抑制或都不受影響，但還有一些表型，如主莖分枝數(shù)量、最終株高、果莢長度，在兩個(gè)背景中受到四倍化的影響是不同的，顯示出四倍化對(duì)植株的作用會(huì)受到整體基因組背景的影響。在育性方面，發(fā)現(xiàn)多倍化導(dǎo)致每果莢種子數(shù)變少。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了本研究中所誘導(dǎo)得來的新制四倍體C313與L311相對(duì)于四倍體對(duì)照，每果莢中種子更少，體現(xiàn)了新制四倍體的特征。盡管種子數(shù)降低了，但不管是二倍體還是四倍體對(duì)照還是本研究中的新制四倍體，都表現(xiàn)出乎了接近100%的發(fā)芽率。

本研究構(gòu)建的帶有qrt1突變的四倍體Col與Ler擬南芥為在四倍體中應(yīng)用四分子分析準(zhǔn)備了材料；結(jié)合本研究中測(cè)定的表型，提供了研究多倍體轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；還發(fā)現(xiàn)了新制四倍體與相對(duì)穩(wěn)定四倍體之間的表型差異，提供了研究新制四倍體中染色體組如何變化并趨于穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

4 結(jié)論

利用秋水仙素處理帶有qrt1突變的Col與Ler生態(tài)型擬南芥，通過流式細(xì)胞技術(shù)與熒光原位雜交計(jì)數(shù)篩選出成功加倍的、帶有qrt1突變的四倍體Col與Ler生態(tài)型擬南芥，并觀察測(cè)量了8個(gè)遺傳背景擬南芥的多個(gè)營養(yǎng)與生殖表型，發(fā)現(xiàn)了qrt1突變以及倍性對(duì)擬南芥不同表型的差異化影響。