李益，馬先鋒，唐浩，李娜，江東，龍桂友，李大志，牛英，韓瑞璽，鄧子牛

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柑橘品種鑒定的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)和指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建

李益1，馬先鋒1，唐浩2，李娜1，江東3，龍桂友1，李大志1，牛英4，韓瑞璽2，鄧子牛1

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；4廣西特色作物研究院，廣西桂林 541004）

【目的】篩選出一套SSR核心引物，用于構(gòu)建柑橘品種的DNA指紋圖譜庫(kù)，為柑橘種苗認(rèn)證、品種登記和植物新品種保護(hù)提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳愿涕賹?個(gè)主要栽培種類為試材進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出多態(tài)性豐富、擴(kuò)增條帶穩(wěn)定的引物對(duì)部分參試品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行進(jìn)一步的引物篩選；篩選得到的引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，并選用部分柑橘品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用基因分析儀檢測(cè)，分別計(jì)算各引物的值、等位基因數(shù)目，選取一套多態(tài)性豐富的適合進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)的SSR引物組合，進(jìn)而對(duì)所有參試品種進(jìn)行分析，構(gòu)建柑橘品種的DNA指紋圖譜庫(kù)，同時(shí)利用篩選的SSR標(biāo)記對(duì)參試品種進(jìn)行鑒定。【結(jié)果】初期以柑橘屬8個(gè)種的代表品種（太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大紅甜橙、鄧肯葡萄柚、枸櫞、費(fèi)米耐勞檸檬和墨西哥來(lái)檬）為材料，用362對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，初步篩選出80對(duì)種間多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物；進(jìn)一步從8個(gè)種類里選擇不同類型的64個(gè)柑橘品種，用上述篩選出的80對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，再篩選出60對(duì)品種類型間多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰的SSR引物，并分別進(jìn)行熒光標(biāo)記；另以168份柑橘品種為材料對(duì)上述60對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)，依據(jù)各引物的值、等位基因數(shù)目、峰圖讀取難易程度、擴(kuò)增穩(wěn)定性及染色體位置等，最終篩選出21對(duì)SSR引物作為指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建的核心引物。為消除不同儀器、不同試驗(yàn)批次等引起的誤差，為21對(duì)SSR引物各主要等位變異選擇相應(yīng)的參照品種。根據(jù)各引物標(biāo)記的熒光顏色及擴(kuò)增片段大小進(jìn)行合理組合，21對(duì)SSR引物可分成5組進(jìn)行多重電泳，共采集500份柑橘品種的DNA指紋。利用SSR標(biāo)記，有111份品種僅用1對(duì)引物即可鑒別，86份品種用2對(duì)引物組合即可鑒別，24份品種用3對(duì)引物組合即可鑒別，另外279份品種雖無(wú)法單獨(dú)一一鑒別，但可分為87個(gè)小組，組內(nèi)品種無(wú)法區(qū)分，組間品種易鑒別?！窘Y(jié)論】利用篩選出的21對(duì)SSR核心引物，構(gòu)建了包含500份柑橘品種的DNA指紋圖譜庫(kù)，篩選出部分品種的特異標(biāo)記，可以鑒別221份柑橘品種和87個(gè)品種組合，構(gòu)建了基于毛細(xì)管電泳平臺(tái)的柑橘SSR分子標(biāo)記品種鑒定體系。

柑橘；SSR；毛細(xì)管電泳；品種鑒定；DNA指紋圖譜庫(kù)

0 引言

【研究意義】柑橘是多年生木本植物，可跨種屬雜交，種屬間雜種多，遺傳背景復(fù)雜。柑橘的主栽品種多起源于芽變，如甜橙、溫州蜜柑等，品種間遺傳背景高度一致，增加了品種鑒定工作的難度。中國(guó)作為柑橘的原生國(guó)之一，柑橘種質(zhì)資源豐富，近年通過(guò)引種和育種，中國(guó)柑橘品種的類型及結(jié)構(gòu)更加多樣化，國(guó)內(nèi)各柑橘產(chǎn)區(qū)也培育了不少優(yōu)良品種[1]?！吨腥A人民共和國(guó)種子法》最新修改版規(guī)定品種需進(jìn)行DUS（Distinctness, Uniformity, Stability）測(cè)試才能登記、審定及保護(hù)，因此，柑橘品種的鑒定工作不斷推進(jìn)。盡管柑橘可根據(jù)枝葉形態(tài)等鑒別其屬種，但柑橘的形態(tài)學(xué)標(biāo)記較少，種內(nèi)品種間的差異不明顯。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記鑒定因快速準(zhǔn)確、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)揮重要作用，滿足品種快速準(zhǔn)確鑒定和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜構(gòu)建的要求[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DNA分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建和種質(zhì)鑒定等，其中SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記均為共顯性遺傳，染色體定位清楚且具有高通量自動(dòng)化的潛力，因此，國(guó)際新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）的生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)工作組（BMT）將其作為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的首選標(biāo)記；而SSR標(biāo)記在單個(gè)位點(diǎn)上的多態(tài)性高于SNP標(biāo)記，技術(shù)研究更加成熟，且SNP的儀器設(shè)備成本高，不利于推廣應(yīng)用，因此，SSR標(biāo)記因其各種優(yōu)勢(shì)在品種鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[3]。近年來(lái)，主要農(nóng)作物的DNA指紋檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成熟，基于SSR分子標(biāo)記的玉米、水稻、大豆、小麥等主要農(nóng)作物的指紋圖譜庫(kù)已構(gòu)建完成[3-10]。SSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于柑橘的研究[11-12]，韓國(guó)輝[13]建立了基于EST-SSR、Genomic-SSR、SCoT的柑橘連鎖圖譜及雜種和多倍體遺傳分析；郭雁君等[14]利用SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)了廣東省肇慶地區(qū)地方柑橘品種與其他部分柑橘屬和近緣屬植物的親緣關(guān)系，為其分類和育種提供理論依據(jù)；曾濤[15]利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了南豐蜜桔的指紋圖譜并分析了各南豐蜜桔的遺傳多樣性；雷天剛等[16]以聚丙烯酰胺凝膠電泳為平臺(tái)，用12對(duì)SSR引物和2個(gè)ISSR引物構(gòu)建柑橘栽培品種（系）的DNA指紋圖譜庫(kù)，并賦予70個(gè)柑橘品種特征指紋代碼?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)柑橘品種DNA指紋庫(kù)的構(gòu)建大多基于瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，但是瓊脂糖凝膠電泳分辨率低，聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠難度較大、步驟多且操作繁瑣，都不適合大量樣品的指紋采集。隨著優(yōu)良品種的不斷選育、品種權(quán)保護(hù)的推廣及育種家對(duì)品種保護(hù)意識(shí)的提高等，這兩個(gè)平臺(tái)已無(wú)法滿足大量品種的DNA指紋鑒定。柑橘的指紋圖譜雖有報(bào)道，但不夠完善?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從一系列基因組SSR和EST-SSR引物中篩選出一套多態(tài)性高、PCR擴(kuò)增穩(wěn)定、熒光峰型易識(shí)別的SSR引物組合，建立更加豐富的柑橘品種指紋圖譜庫(kù)，為柑橘種苗認(rèn)證和DUS測(cè)試過(guò)程中近似品種的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于引物篩選和DNA指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建的種質(zhì)共503份，其中456份來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國(guó)家資源圃，47份來(lái)自國(guó)家柑橘改良中心長(zhǎng)沙分中心，包括9份大翼橙亞屬種質(zhì)、16份枳、10份金柑、9份屬間雜種、20份枸櫞種質(zhì)、162份寬皮柑橘、2份來(lái)檬、51份檸檬、12份葡萄柚、12份酸橙、19份甜橙、8份香橙、121份柚、52份柑橘屬內(nèi)雜種。

1.2 DNA提取

每份種質(zhì)取5片同齡幼嫩葉片等量混合，液氮研磨，采用改良的CTAB法[17]提取基因組總DNA。

1.3 SSR引物的選擇

依據(jù)參考文獻(xiàn)[17-25]報(bào)道的序列共合成362對(duì)SSR引物。在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選后的SSR引物上游5’端隨機(jī)標(biāo)記6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4種熒光染料。普通引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，熒光引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為dNTP 0.20 mmol·L-1、上下游引物各0.25 μmol·L-1、DNA聚合酶0.05 U·μL-1、1×buffer（含Mg2+2.5 mmol·L-1）和樣品DNA 2.5 ng·μL-1。PCR程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃—60℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳40—50 min（恒壓120 V），凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄。變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離1—1.5 h（80 W恒定功率），銀染檢測(cè)[26]。將6-FAM、HEX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物稀釋30倍，TAMRA和ROX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物稀釋15倍，取等量稀釋后的產(chǎn)物混合并變性，上樣至3130XL基因分析儀進(jìn)行片段分析，使用SSR指紋分析器讀取數(shù)據(jù)[7]。

1.5 引物多態(tài)性評(píng)價(jià)

利用（Polymorphism Information Content）評(píng)價(jià)引物多態(tài)性，計(jì)算公式：PIC＝1-∑P2，其中P表示標(biāo)記的第個(gè)等位基因在群體中的頻率[27]。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選和標(biāo)記開(kāi)發(fā)

2.1.1 引物初選 以柑橘屬8個(gè)種的代表品種（太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大紅甜橙、鄧肯葡萄柚、枸櫞、費(fèi)米耐勞檸檬、墨西哥來(lái)檬）為材料，對(duì)362對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中340對(duì)SSR引物擴(kuò)增出目的片段，評(píng)價(jià)每對(duì)引物的多態(tài)性、擴(kuò)增穩(wěn)定性，初步篩選出80對(duì)種間多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物。

2.1.2 引物復(fù)選 從柑橘屬8個(gè)種中選擇不同類型的64份品種作為材料，對(duì)上述80對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，評(píng)價(jià)每對(duì)引物的多態(tài)性、擴(kuò)增穩(wěn)定性和條帶清晰度等，篩選出60對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定、帶型較清晰的SSR引物（圖1）。

2.1.3 引物精選 對(duì)上述篩出的60對(duì)SSR引物標(biāo)記熒光染料，從柑橘屬8個(gè)種中的選擇不同類型的168份柑橘品種為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，根據(jù)各引物的值、等位基因數(shù)目、峰圖讀取的難易程度及染色體位置等，最終篩選出21對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定、毛細(xì)管電泳峰型易讀取且在染色體上分布均勻的SSR引物作為指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建的核心引物[28]。21個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息量（）變幅為0.550—0.871，平均為0.733（圖2、表1和表2）。

2.1.4 標(biāo)記的校正統(tǒng)一與參照品種的選擇 統(tǒng)計(jì)各柑橘（品）種在21個(gè)SSR位點(diǎn)上的擴(kuò)增片段大小并取整，用取整后的片段大小命名各等位變異。為消除不同儀器型號(hào)、不同試驗(yàn)批次等造成的系統(tǒng)誤差并保證不同電泳平臺(tái)數(shù)據(jù)的一致性，為每對(duì)SSR引物的各等位變異選擇相應(yīng)的參照品種（代表核心位點(diǎn)主要等位變異的一組樣品，輔助確定待測(cè)樣品在某個(gè)位點(diǎn)上的等位變異大?。ū?）。

2.2 柑橘（品）種DNA指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建

根據(jù)引物標(biāo)記的熒光顏色及等位變異的大小范圍進(jìn)行組合，21對(duì)SSR引物可分成5組（表3），每組3—6對(duì)引物，同一組引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后進(jìn)行多重電泳，可提高試驗(yàn)效率、降低成本。提取各柑橘樣品的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物依據(jù)引物分組進(jìn)行毛細(xì)管多重電泳，采集各柑橘種質(zhì)在21個(gè)SSR位點(diǎn)上的指紋數(shù)據(jù)，建立了包含500份柑橘種質(zhì)的DNA指紋圖譜庫(kù)。在21個(gè)位點(diǎn)中共檢測(cè)到253個(gè)等位變異，每個(gè)位點(diǎn)的等位變異數(shù)為4—19個(gè)，平均約12個(gè)（表3）。

M：25 bp DNA Step ladder，1：福橘；2：興義大紅袍；3：南橘；4：黃果柑；5：早熟；6：陽(yáng)山橘；7：本地早；8：甌柑；9：早熟克里曼丁；10：貢柑；11：永春椪柑；12：黃巖椪柑；13：太田椪柑；14：日南1號(hào)；15：大分4號(hào)；16：伊予柑；17：溫嶺高橙；18：秋輝；19：諾瓦；20：清見(jiàn)；21：維諾拉；22：世界蜜柚；23：默科特；24：凱旋柑；25：早香；26：陽(yáng)香；27：桂平朱砂橘；28：滿頭紅；29：印度酸橘；30：枸頭橙；31：代代；32：朱欒；33：無(wú)核雪柑；34：莫洛；35：大紅甜橙；36：夏沙蜜柚；37：北碚柚；38：金蘭柚；39：五布紅心柚；40：強(qiáng)德勒柚；41：勐倫早柚；42：橘湘紅；43：沙田柚；44：馬家柚；45：玉環(huán)柚；46：四季拋；47：曼賽龍柚；48：奧羅布蘭克；49：鄧肯葡萄柚；50：馬敘葡萄柚；51：雞尾葡萄柚；52：木里香櫞；53：小香櫞；54：長(zhǎng)果香櫞；55：美國(guó)枸櫞；56：枸櫞；57：野生香櫞；58：大香櫞；59：墨西哥來(lái)檬；60：印特多納多；61：尤力克檸檬；62：橙花；63：白黎檬；64：北京檸檬

圖2 引物P8在4個(gè)柑橘品種中檢測(cè)到的等位變異

2.3 特異標(biāo)記的篩選和種質(zhì)鑒定

篩選了部分柑橘屬種的特異標(biāo)記（屬、種內(nèi)品種間條帶一致，同時(shí)區(qū)別于其他屬、種的品種），為跨屬種雜交后代的鑒定及柑橘品種的屬種鑒別提供參考（表4）。

分析500份柑橘種質(zhì)在21個(gè)位點(diǎn)上的指紋數(shù)據(jù)，221份柑橘種質(zhì)可準(zhǔn)確鑒別：獨(dú)立標(biāo)記可鑒別111份種質(zhì)，2對(duì)引物組合可鑒別86份種質(zhì)，3對(duì)引物組合可鑒別24份種質(zhì)，大翼橙亞屬、枸櫞、雜柑、柚類等易鑒別；279份種質(zhì)暫時(shí)無(wú)法鑒別，但可分成87組，每組包含2—17份種質(zhì)，同組的種質(zhì)暫時(shí)無(wú)法區(qū)分，但組間種質(zhì)易鑒別；不能鑒別的種質(zhì)主要為芽變品種或同物異名，如溫州蜜柑、椪柑、葡萄柚、檸檬、甜橙等種質(zhì)難以鑒別。

3 討論

良種是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，優(yōu)良品種的選育工作受到越來(lái)越多的重視，本研究的植物材料“柑橘”為木本果樹(shù)，開(kāi)花結(jié)果需要經(jīng)歷“童期”這一特殊植物生理階段，因此果樹(shù)新品種的選育需投入大量的時(shí)間、精力和財(cái)力，如果選育的新品種不能得到有效保護(hù)，會(huì)打擊育種者的積極性，不利于品種的持續(xù)創(chuàng)新[29]。植物新品種保護(hù)是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略的重要組成部分，中國(guó)越來(lái)越重視植物品種權(quán)的保護(hù)，育種者的保護(hù)意識(shí)不斷提高，柑橘新品種保護(hù)的申請(qǐng)量和DUS測(cè)試量逐年增加；但是由于柑橘具有：（1）不同屬、種或品種間可相互授粉雜交，雜種類型繁多；（2）柑橘栽培品種主要通過(guò)嫁接等無(wú)性繁殖方式繁育，易通過(guò)自我繁殖竊取新品種權(quán)益；（3）同一品種在不同種植區(qū)域往往存在不同名稱的現(xiàn)象，導(dǎo)致柑橘品種的監(jiān)管難度大。近年來(lái)，柑橘產(chǎn)業(yè)受黃龍病、潰瘍病等病害的影響，產(chǎn)量和質(zhì)量都大大降低，優(yōu)良苗木需求旺盛[30-31]，各柑橘主產(chǎn)省份已建成或正在新建無(wú)病毒苗圃，且部分研究機(jī)構(gòu)已開(kāi)展柑橘的種苗認(rèn)證工作，明確柑橘苗木的真實(shí)身份。UPOV將DUS測(cè)試作為新品種登記和保護(hù)的基本條件[32]，本研究篩選的柑橘SSR引物及建立的DNA指紋圖譜庫(kù)可用于柑橘新品種DUS測(cè)試中近似品種的篩選以及種苗市場(chǎng)監(jiān)管的身份快速鑒定，有利于柑橘育種和品種資源保護(hù)。

表1 引物編號(hào)及序列

表2 用于柑橘屬（品）種DNA指紋鑒定的21個(gè)標(biāo)記

續(xù)表2 Continued table 2

參照品種是代表核心位點(diǎn)主要等位變異的一組樣品。輔助確定待測(cè)樣品在某個(gè)位點(diǎn)上等位變異的大小，校正儀器設(shè)備的系統(tǒng)誤差

The reference variety is a set of samples representing the main alleles of the core site. Being used to assist in determining the size of an extended segment of the size of alleles at a certain site, correcting of system error of instrument and equipment

表3 21個(gè)熒光標(biāo)記引物的分組

括號(hào)內(nèi)為等位變異的大小范圍 The number in the brackets indicate the range of allele sizes

表4 柑橘屬種的特異標(biāo)記

252/265代表引物在樣品中擴(kuò)增出2條片段，一條為252 bp，一條為265 bp?！?”表示暫未找到該屬種的特異標(biāo)記

252/265 represent that primer is amplified in two fragments in the sample, with a size of 252 bp and a size of 265 bp. “/” means that this specific molecular of genus-species currently have not be found

目前，柑橘品種鑒定和指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建取得了較好的進(jìn)展。吳鑫[33]篩選出34對(duì)SSR引物和3個(gè)ISSR引物對(duì)126份柑橘材料進(jìn)行鑒定，SSR標(biāo)記可鑒定66份品種，ISSR標(biāo)記可鑒定27份品種；雷天剛等[16]篩選出12對(duì)SSR引物和2個(gè)ISSR引物對(duì)102份柑橘材料進(jìn)行鑒定，SSR標(biāo)記可鑒定42份品種，ISSR標(biāo)記可鑒定28份品種。本研究用21對(duì)SSR引物鑒定500份柑橘種質(zhì)，其中221份材料可準(zhǔn)確鑒別，SSR標(biāo)記在寬皮柑橘、雜柑、柚類等品種間多態(tài)性高，與前人的結(jié)果一致；將暫時(shí)區(qū)分不開(kāi)的材料歸為一類，剩余的279份材料分為87類，不同類的品種易鑒別。由于SSR標(biāo)記在甜橙、溫州蜜柑、紅橘等芽變品種中的多態(tài)性較低，前人利用ISSR標(biāo)記能夠鑒別部分芽變品種，考慮到ISSR標(biāo)記重復(fù)性差、非特異性片段多、數(shù)據(jù)間難以整合，不適于毛細(xì)管電泳平臺(tái)，因此，本研究未選用ISSR標(biāo)記。本研究選用的品種覆蓋了柑橘屬各主栽品種、枸櫞、酸橙及枳屬和金柑屬的部分（品）種，具有較好的代表性。篩選的21對(duì)SSR引物在染色體上分布較均勻、多態(tài)性高，通過(guò)特異標(biāo)記及其組合可以有效鑒別目前大多數(shù)廣泛栽培的品種。另外，本研究利用毛細(xì)管電泳平臺(tái)構(gòu)建DNA指紋圖譜庫(kù)，克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、自動(dòng)化程度低的缺點(diǎn)，能夠高通量地采集數(shù)據(jù)，提高品種鑒定的效率[34]。柑橘是多年生木本植物，具有童期長(zhǎng)、遺傳背景復(fù)雜、部分栽培品種為芽變品種等特點(diǎn)，而芽變屬體細(xì)胞變異，與芽變母本的遺傳背景一致，SSR引物難以覆蓋到變異位點(diǎn)，因此，SSR標(biāo)記用于柑橘品種的鑒定存在一定的局限性[35]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，可結(jié)合SNP或簡(jiǎn)化基因組測(cè)序用于進(jìn)一步鑒定芽變品種[36-38]。

4 結(jié)論

篩選出21對(duì)SSR核心引物，建立了基于毛細(xì)管電泳平臺(tái)的柑橘品種SSR分子標(biāo)記鑒定體系，構(gòu)建了包含500份柑橘種質(zhì)的DNA指紋圖譜庫(kù)，可用于柑橘品種的鑒別。

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（責(zé)任編輯 李莉）

SSR markers screening for identification of citruscultivar and construction of DNA fingerprinting library

LI Yi1, MA XianFeng1, TANG Hao2, LI Na1, JIANG Dong3, LONG GuiYou1, LI DaZhi1, NIU Ying4, HAN RuiXi2, DENG ZiNiu1

(1College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;2Development Center for Science and Technology, Ministry of Agriculture, Beijing 100122;3Institute of Citrus Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712;4Guangxi Academy of Specialty Crops, Guilin 541004, Guangxi)

【Objective】The purpose of the present work aims at the construction of DNA fingerprint library of citrus cultivar by using a series of SSR core primers in order to provide references for citrus nursery plant identification, cultivars registration and plant variety protection. 【Method】SSR primers were primarily screened by analyzing 8 mainly cultivated species belonging towhile the PCR products were separated by agarose gel electrophoresisthe primers that generated high polymorphic and stable PCR products were chosen for further PCR amplification with more citrus cultivars, and the PCR products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis. the further screened primers were labeled with fluorescent and used for amplification of the all tested cultivars. The PCR products were detected by fluorescence capillary electrophoresis and the primers suitable for fluorescent capillary electrophoresis were screened according to their, number of alleles identified, and employed to construct the citrus cultivar DNA fingerprinting library, and the selected primers were used to identify the tested cultivars.【Result】Firstly, 80 pairs of polymorphic and stable primers were chosen from 362 SSR primers by 4% agarose gel electrophoresis with representative cultivars of 8 species ofgenus(including Ota ponkan, Shatian pummelo, Yuanjiang soar orange, Dahong sweet orange, Duncan grapefruit, citron, Femminello lemon, Mexico lime); Secondly, 60 pairs of SSR primers with high polymorphism, stability and clear amplification products were further selected from the above 80 pairs of primers by 6% polyacrylamide gel electrophoresis with 64 citrus cultivars and labeled with fluorescent dyes; Thirdly, 21 pairs of SSR core primers were verified for the construction of fingerprint library from above 60 pairs of primers by capillary electrophoresis with 168 citrus cultivars on the basis of, the allele number, peak reading difficulty, amplification stability and chromosome location. The corresponding reference cultivars were selected for 21 pairs of primers to eliminate the errors caused by different instruments and experimental batches. Through the multiple electrophoresis with the 5 combination groups of 21 primers according to the color and size of amplified fragment, we established 500 citrus cultivars fingerprinting library. Among the tested cultivars, 111 were identified by using only one pair of primers, 86 with the combination of two pairs of primers; and 24 with the combination of 3 pairs of primers, the remaining 279 cultivars were not able to be identified individually, they could, however, be divided into 87 groups, between which it was clearly distinguished but within which the cultivars were indistinguishable.【Conclusion】The DNA fingerprint library containing 500 citrus cultivars was constructed by using 21 pairs of screened SSR core primers, the specific markers for some cultivars were selected; 221 cultivars and 87 cultivar groups were identified; and a citrus cultivar identification system based on SSR fluorescence labeling was constructed.

; SSR; capillary electrophoresis; variety identification; DNA fingerprints

2018-01-19；

2018-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金（31720103915）、2018年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管專項(xiàng)（111721301092361007）、廣西柑橘新品種選育及無(wú)病毒苗木繁殖研究特聘專家崗位

李益，E-mail：1946494060@qq.com。通信作者鄧子牛，E-mail：deng7009@163.com。通信作者韓瑞璽，E-mail：wudifeixue007@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0012