虞 舟，白 冬，張海玲，謝 超

（1.舟山昌國食品有限公司，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；3.舟山富晟食品科技有限公司，浙江舟山 316025）

鰹魚Katsuwonus pelamis，俗稱炸彈魚，屬于金槍魚科Thunnidae，其產(chǎn)量占金槍魚漁業(yè)的40%[1-3]。鰹魚蛋白質(zhì)含量高，氨基酸比例合理，且種類豐富；膽固醇和脂肪含量低，而且DHA和EPA等多不飽和脂肪酸含量豐富，且ω-3多不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)元素含量豐富，氨基酸配比合理，符合現(xiàn)代人群健康飲食消費(fèi)觀念，是很好的蛋白質(zhì)來源食品并且是便于人體吸收利用的健康食品[4-6]。高頤雄等[7]研究了舟山海域的31種海魚中脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)扁舵鰹Auxis thazard的總脂肪高達(dá)13.2%且n-3多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為2.62%。也有研究報(bào)道，金槍魚和鰹魚等大型洄游性魚的內(nèi)臟和眼窩中含有30%～40%二十二碳六烯酸（DHA）以及5%～10%的二十碳五烯酸（EPA）[8-9]。周敏等[10]測定了黃鰭金槍魚Thunnus albacores眼窩油中DHA的含量為19.6 mg/g，占總脂肪含量的27.1%，比例較高，適用于DHA相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。

衰老又稱老化，是各生物所必然經(jīng)歷的一種過程，是生物在正常狀況下發(fā)育成熟之后，機(jī)體各組織器官功能隨時(shí)間的流逝而減退，自身應(yīng)急免疫能力下降，內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不穩(wěn)定因素，各結(jié)構(gòu)組分不可抗拒的退行變化的現(xiàn)象[11-13]。衰老不可逆轉(zhuǎn)，但是可以干預(yù)延緩衰老[14-15]，保持機(jī)體具有足夠的抗氧化物質(zhì)，增加抗氧化酶活性，及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過量的自由基，減緩其對細(xì)胞和組織的破壞，從而維持了細(xì)胞和組織的正常功能，達(dá)到保持機(jī)體健康和抗衰老的目的[16-17]。深海魚油中富含DHA和EPA等多不飽和脂肪酸，對人體正常發(fā)育和保持健康有重要意義，還可預(yù)防和治療多種疾病[18-19]，幼兒及青少年及時(shí)補(bǔ)充DHA和EPA，可促進(jìn)其視力以及智力的發(fā)育，中老年人及時(shí)補(bǔ)充可預(yù)防延緩由衰老所帶來的一系列疾病，如心腦血管疾病，高血壓，高血脂，視力下降，老年癡呆等癥狀[20-22]。

目前鰹魚肌肉營養(yǎng)成分的分析和評價(jià)與保鮮維持品質(zhì)的研究報(bào)道較多，鮮有有關(guān)鰹魚魚油生物活性功能的評價(jià)，本文探討深海鰹魚魚油對D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠抗衰老功能的影響，以期為鰹魚油抗氧化、抗衰老能力提供新的理論數(shù)據(jù)，也為鰹魚的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠，平均體質(zhì)量在18～22 g，雄性，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測站。

鰹魚魚油由實(shí)驗(yàn)室提取、精制，DHA，EPA含量為45%，高于一般市售魚油；D-半乳糖、冰醋酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品；谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、總超氧化物酶試劑盒、丙二醛測定試劑盒、過氧化物酶試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；市售金槍魚油，主要原料為金槍魚油，維生素E，檸檬酸，其中DHA，EPA含量為29.6%，上海恒壽堂藥業(yè)有限公司制造。

BT125D型電子天平，塞利多斯科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；16K-M高速離心機(jī)，長沙鑫奧儀器儀表有限公司出品；THERMO酶標(biāo)儀，上海輔澤商貿(mào)有限公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組

將小鼠（21±2 g）在清潔安靜溫度適宜的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：25±2℃，每12 h晝夜間斷性照明。3 d后取出，隨機(jī)分成6組，每組8只，即空白對照組（BC）；鰹魚魚油組：即低劑量組（LD）、中劑量組（MD）、高劑量組（HD）；D-半乳糖模型組（NC）；陽性對照組（PC、市售金槍魚油）。

1.2.2 小鼠給藥

采用皮下注射方式，給鰹魚魚油組、陽性對照組和D-半乳糖模型組每只小鼠每天注射濃度為的4%D-半乳糖（1 000 mg/kg），空白組小鼠每只每天注射等體積 0.9%的生理鹽水，連續(xù)注射6周。注射4%D-半乳糖的同時(shí),鰹魚魚油制劑組分別每天灌胃10mL/kg bw不同質(zhì)量濃度的魚油（20，50，100 mg/mL），陽性對照組灌胃市售魚油（1 000 mg/kg），空白對照組和D-半乳糖模型組灌胃等體積生理鹽水[23]。

1.2.3 灌胃方法

將小鼠用左手抓緊小鼠背部和頭部的皮毛，使其固定，并使其頭部后仰，與身體成一水平直線，將針頭自口腔右側(cè)沿上顎垂直緩慢下行，灌藥，觀察小鼠呼吸正常與否[24]。

1.2.4 組織處理及準(zhǔn)備

（1）血清準(zhǔn)備：采血前12 h禁食，采血1 h前禁水，選用眼球摘除采血法采血，立即4 000 r/min離心15min取血清，-80 ℃保存[25]。

（2）肝組織：脫頸處死小鼠后，剪開腹腔完整取出小鼠肝臟后用4℃生理鹽水清洗，濾紙吸干，保存在Bouin氏固定液中，制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色觀察肝臟組織病理變化情況。

（3）肝勻漿制備：脫頸處死小鼠后，剪開腹腔完整取出小鼠肝臟加入4℃預(yù)冷生理鹽水制成10%的肝臟組織勻漿，低溫離心機(jī)4℃3 000 r/min離心10～15min,取出上清液，加入生理鹽水配置成實(shí)驗(yàn)所需的各濃度，4℃保存待測。

1.2.5 肝脾指數(shù)的測定

根據(jù)小鼠體重、肝臟重量以及脾臟重量計(jì)算出肝指數(shù)和脾指數(shù)，公式如下

1.2.6 生化指標(biāo)的測定

測定GSH-Px，T-SOD，CAT活性以及MDA含量等指標(biāo)，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.7 肝臟切片及HE染色

小鼠肝臟組織于Bouin氏固定液中固定24 h，取出修整，梯度乙醇脫水而后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切3 μm厚切片，染色，脫水后封片，然后在光學(xué)電子顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況[26-27]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.1、SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（采用SNK法分析測驗(yàn)顯著性水平，P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝指數(shù)和脾指數(shù)

結(jié)果如圖1和圖2。

圖1 各組小鼠的肝指數(shù)Fig.1 The liver index in different groups mice

圖2 各組小鼠的脾指數(shù)Fig.2 The thymus index in different groups mice

如圖1所示，與陰性對照組相比，鰹魚魚油中、高劑量組和空白對照組的肝指數(shù)呈明顯下降趨勢（P<0.05），低劑量組肝指數(shù)表現(xiàn)一定的下降趨勢（P>0.05）。圖2為各組小鼠的脾指數(shù)，鰹魚魚油高劑量組、空白對照組和陽性對照組與陰性對照組相比脾指數(shù)顯著下降（P<0.05），低、中劑量組表現(xiàn)為下降趨勢，但差異并不顯著。結(jié)果表明鰹魚魚油可在一定程度上降低小鼠肝脾指數(shù)。

2.2 小鼠肝臟生化指標(biāo)

通過大量試驗(yàn)證明，小鼠經(jīng)D-半乳糖注射誘導(dǎo)可以導(dǎo)致其加速衰老，并且有類似于自然衰老的各種生理生化的老化表現(xiàn)[28-29]。表1所示為各組小鼠肝組織中生化指標(biāo)的結(jié)果。與空白對照組相比，D-半乳糖模型組中GSH-Px，T-SOD以及CAT指標(biāo)結(jié)果均降低，差異有顯著性（P<0.01）。MDA含量顯著升高（P<0.01），說明D-半乳糖致衰老型小鼠造模成功。與D-半乳糖模型組相比，鰹魚魚油各劑量組與陽性對照組均提升了肝勻漿GSH-Px，T-SOD以及CAT活性，差異性顯著，且各指標(biāo)隨鰹魚魚油劑量的增加而升高，均降低了MDA的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明了鰹魚魚油能夠提高肝組織GSH-Px，T-SOD以及CAT活性，降低MDA含量，有緩解衰老的效果且HD組的作用最為明顯。這表示鰹魚魚油中不飽和脂肪酸有可能替代了機(jī)體內(nèi)的還原物質(zhì)，使其免受氧化而維持了正常的生理功能。

表1 鰹魚魚油對衰老小鼠肝勻漿中GSH-Px，T-SOD,CAT和 MDA的影響（x±s）Tab.1 Effects of skipjack tuna oil on liver homogenate SOD,GSHPx,T-AOC,CAT and MDA （x±s）

2.3 小鼠血液生化指標(biāo)

表2為各組小鼠血清生化指標(biāo)的結(jié)果。由表2可知，D-半乳糖模型組與空白對照組相比，血清中GSH-Px，T-SOD 活性顯著下降（P<0.01），CAT 活性明顯下降（P<0.05），MDA 含量顯著上升（P<0.01），再次驗(yàn)證造模成功。與D-半乳糖模型組相比，高劑量組可顯著提升GSH-Px，T-SOD和CAT活性（P<0.01）并降低 MDA 含量（P<0.01）；中劑量組能顯著提高 GSH-Px活性（P<0.01），顯著降低 MDA 含量（P<0.01）；陽性對照組能夠顯著提升GSH-Px活性（P<0.01），T-SOD和CAT活性升高明顯（P<0.05），MDA含量顯著下降。說明鰹魚魚油中高劑量組緩解衰老的效果與市售魚油的效果相似，均可提升GSH-Px，T-SOD以及CAT活性，且使細(xì)胞中MDA含量下降到正常水平從而達(dá)到延緩衰老的作用。

表2 鰹魚魚油對衰老小鼠血清中GSH-Px,T-SOD,CAT和MDA的影響（x±s）Tab.2 Effects of skipjack tuna oil on serum SOD,GSH-Px,T-AOC,CAT and MDA （x±s）

2.4 小鼠肝臟組織切片觀察分析

各組小鼠肝組織切片HE染色結(jié)果如圖3所示。空白對照組小鼠中央靜脈結(jié)構(gòu)正常，呈較為規(guī)則的圓形，肝竇正常，肝索排列規(guī)范無異常，肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；D-半乳糖模型組與空白對照組相比，肝索排列雜亂無序，肝竇擴(kuò)張明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞可見雙核；陽性對照組肝細(xì)胞體積較D-半乳糖模型組增大，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊規(guī)范，肝竇無明顯擴(kuò)張；HD組肝細(xì)胞大小與結(jié)構(gòu)未見明顯異常，肝小葉結(jié)構(gòu)無異常，肝竇無擴(kuò)張，肝索排列結(jié)構(gòu)正常；MD組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)范，肝竇未見明顯擴(kuò)張，肝小葉與肝索結(jié)構(gòu)無異常；LD組部分肝細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)雙核細(xì)胞，肝索及肝竇結(jié)構(gòu)未見明顯異常[28～31]。

由此可見，鰹魚魚油可減緩細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的破壞，保護(hù)細(xì)胞以及組織功能正常，延緩衰老的進(jìn)程。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D-半乳糖小鼠連續(xù)攝入鰹魚魚油6周后，小鼠體內(nèi)抗氧化酶（GSH-Px，T-SOD以及CAT）活性得到顯著提升，MDA含量明顯下降，與NC組相比差異有顯著性，且效果與鰹魚魚油攝入含量成正比。鰹魚魚油含有豐富的不飽和脂肪酸，特別是DHA和EPA，因此含有豐富的不飽和鍵，從而可代替生物機(jī)體完成正常代謝過程中的氧化環(huán)節(jié)，可有效的清除過量自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化酶活性進(jìn)一步提升清除自由基的能力。同時(shí)，觀察肝臟切片HE染色結(jié)果可知，相比于NC組，鰹魚魚油制劑組肝細(xì)胞大小與結(jié)構(gòu)未見明顯異常，肝小葉結(jié)構(gòu)無異常，肝竇無擴(kuò)張，肝索排列結(jié)構(gòu)正常，HD組與空白對照組染色結(jié)果相似，效果較佳。

圖3 小鼠各組肝組織切片HE染色結(jié)果（100×）Fig.3 Representative photography mangnification,×100 hematoxylin and eosin （HE）staining of liver in mice