梁高楊 李小勤 楊 航 POOLSAWAT Lumpan 高擘為 冷向軍*

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

抗生素的長(zhǎng)期使用帶來(lái)的病原菌抗藥性和藥物殘留問(wèn)題嚴(yán)重危害了水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展[10]，尋找安全有效的抗生素替代產(chǎn)品一直是水產(chǎn)研究的熱點(diǎn)。茶多酚具有廣泛的抗菌譜，能夠抑制多種病原菌的生長(zhǎng)[11-12]，并且茶多酚能夠提高魚(yú)類(lèi)的免疫性能[13-14]，是一種潛在的抗生素替代物。本試驗(yàn)以?shī)W尼羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus×O.aureus)為研究對(duì)象，在飼料中添加不同水平的茶多酚，考察其對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)、消化功能、免疫性能和抗嗜水氣單胞菌感染能力的影響，為茶多酚在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚(yú)粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕為主要蛋白質(zhì)源，豆油為主要脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料(粗蛋白質(zhì)含量32.06%，粗脂肪含量5.62%)。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對(duì)照組)、100、200、400、600、800 mg/kg的茶多酚[14]，配制6種試驗(yàn)飼料，另在飼料中加入0.05%氧化釔(Y2O3)，以測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。主要飼料原料粉碎后過(guò)40目篩，逐級(jí)混合，用單螺桿擠壓機(jī)(SLP-45，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械研究所)制成直徑2 mm的硬顆粒沉性飼料，制粒溫度為(85±5) ℃，55 ℃烘干后4 ℃冰箱保存。基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。茶多酚由山東豐泰生物科技有限公司提供，純度為98%。

1.2 試驗(yàn)用魚(yú)及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在上海海洋大學(xué)濱海特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，養(yǎng)殖時(shí)間為9周。試驗(yàn)用奧尼羅非魚(yú)購(gòu)于上海新場(chǎng)羅非魚(yú)良種養(yǎng)殖場(chǎng)，于試驗(yàn)開(kāi)始前用對(duì)照組飼料馴養(yǎng)1周。選取450尾平均體重為(6.09±0.07) g的奧尼羅非魚(yú)，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾魚(yú)，以重復(fù)為單位隨機(jī)分配到18口網(wǎng)箱(1.5 m×1.0 m×1.2 m)中，每6口網(wǎng)箱置于一口室內(nèi)水泥池(5.0 m×3.0 m×1.2 m)內(nèi)，共3口水泥池，位于同一室內(nèi)車(chē)間內(nèi)，水源均為過(guò)濾后的池塘水。試驗(yàn)魚(yú)表觀飽食投喂，日投喂3次(08:00、12:00、17：00)。試驗(yàn)期間，每周換水2次，每次換水1/3，水溫(28±2)℃，pH 7.5±0.5，溶氧濃度>6.0 mg/L，氨氮濃度<0.2 mg/L。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)飼料原料購(gòu)自上海農(nóng)好飼料有限公司，其中魚(yú)粉(秘魯)、豆粕、菜籽粕、棉籽粕的粗蛋白質(zhì)含量分別為65.18%、44.65%、36.64%、44.77%。The feed ingredients were purchased from theShanghaiNonghaoFeed Co., Ltd., and the crude protein content of fish meal (Peru), soybean meal, rapeseed meal and cottonseed meal was 65.18%, 44.65%, 36.64% and 44.77%, respectively.
2)維生素預(yù)混料為每千克飼料提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet:VA 6 000 IU,VD31 000 IU,VE 60 IU,VK 5 mg,VB115 mg,VB215 mg,VB330 mg,VB535 mg,VB620 mg,生物素 biotin 2 mg,葉酸 folic acid 3 mg,VB120.03 mg。
3)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供The mineral premix provided the following per kg of the diet:Ca(IO3)20.04 g,CoCl2·6H2O 0.01 g,FeSO4·H2O 0.446 g,ZnSO4·H2O 0.232 g,MnSO4·H2O 0.063 g,NaSeO3·5H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.645 g。

1.3 樣品采樣和指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，記錄試驗(yàn)魚(yú)尾數(shù)并稱(chēng)重，用于計(jì)算生長(zhǎng)指標(biāo)；每口網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾魚(yú)，測(cè)量體長(zhǎng)，解剖取內(nèi)臟和肝臟，稱(chēng)重用于計(jì)算形體指標(biāo)。相關(guān)計(jì)算公式如下：

增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(終末均重-初始均重)/初始均重；飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=總攝食量/(終末均重-初始均重)；存活率(survival rate,SR,%)=100×終末魚(yú)尾數(shù)/初始魚(yú)尾數(shù)；采食量(feed intake,FI,g)=總攝食量/魚(yú)尾數(shù)；肝體指數(shù)(hepatosomatic index,HSI,%)=100×肝臟重/體重；臟體指數(shù)(viscerosomatic index,VSI,%)=100×內(nèi)臟重/體重；肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=100×體重/體長(zhǎng)3。

1.3.2 飼料和全魚(yú)常規(guī)成分分析

在魚(yú)體稱(chēng)重之后，每口網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾魚(yú)，用于全魚(yú)常規(guī)成分分析。飼料和全魚(yú)中水分含量的測(cè)定采用105 ℃烘干法，粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(全自動(dòng)凱氏定氮儀，Kjeltec-2300，福斯有限公司，瑞典)，粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏抽提法(脂肪測(cè)定儀，SOX-416，格哈特有限公司，德國(guó))，粗灰分含量的測(cè)定采用550 ℃馬弗爐灼燒法(程控箱式電爐，SXL-1008，上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3.3 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定

每口網(wǎng)箱另隨機(jī)取3尾魚(yú)，尾靜脈取血，4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)，取血清分裝后-80 ℃冰箱保存。血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、堿性磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)、溶菌酶(lysozyme,LZM)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的生化試劑盒測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。SOD和AKP活性使用酶標(biāo)儀(Synergy 2，伯騰儀器有限公司，美國(guó))測(cè)定；MDA含量和LZM活性使用分光光度計(jì)(722型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定。

1.3.4 腸道消化酶活性的測(cè)定

將每口網(wǎng)箱抽血后的3尾魚(yú)在冰上解剖后取前腸(胃到腸道第1個(gè)彎曲點(diǎn))，生理鹽水沖去食糜，-80 ℃冰箱保存。測(cè)定前，將前腸于4 ℃解凍，加9倍體積生理鹽水，冰水浴勻漿，4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)，取上清用于消化酶活性的測(cè)定。

淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的生化試劑盒測(cè)定，組織中每毫克蛋白質(zhì)在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活性單位。蛋白酶活性采用福林酚法測(cè)定，以2%酪蛋白溶液為底物，每微克組織蛋白質(zhì)在pH 7.2、37 ℃條件下每分鐘分解酪蛋白生成1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)蛋白酶活性單位。腸道蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.3.5 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率測(cè)定

養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始30 d后，在正常投喂的同時(shí)，連續(xù)10 d采集糞便，用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。每次于投喂2 h后，虹吸法收集糞便，取包膜完整、連續(xù)的糞便于60 ℃烘干，-20 ℃保存待測(cè)。飼料和糞便中Y2O3含量測(cè)定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(等離子體發(fā)射光譜儀，Optima 8000DV，帕金埃爾默股份有限公司，美國(guó))，糞便中粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定同1.3.2中方法。

干物質(zhì)表觀消化率(%)=100×(1-b/B)；粗蛋白質(zhì)表觀消化率(%)=100×[1-(A/a)×(b/B)]。

式中：a、A分別表示飼料和糞便中粗蛋白質(zhì)含量；b、B分別表示飼料和糞便中Y2O3含量。

1.3.6 嗜水氣單胞菌攻毒試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)網(wǎng)箱取12尾魚(yú)，進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒試驗(yàn)。攻毒所用嗜水氣單胞菌來(lái)自上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)(呂利群實(shí)驗(yàn)室)。將菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082，上海善志儀器設(shè)備有限公司)，純化培養(yǎng)24 h，挑取單克隆菌株于無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)30 h，3 500 r/min離心5 min，去除上清，無(wú)菌生理鹽水稀釋至濃度為1.1×108CFU/mL。每尾試驗(yàn)魚(yú)腹腔注射濃度為1.1×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液0.2 mL(濃度和劑量根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定)。記錄攻毒后1、24、48、96 h死亡個(gè)數(shù)，計(jì)算累積死亡率。

累積死亡率(cumulative mortality,CM,%)=100×累積死亡尾數(shù)/初始魚(yú)總尾數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)(存活率除外)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時(shí)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)和形體指標(biāo)的影響

茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)和形體指標(biāo)的影響見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)9周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，各組奧尼羅非魚(yú)的存活率均為100%，且在采食量上無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，各茶多酚添加組的增重率和飼料系數(shù)均無(wú)顯著變化(P>0.05)，但100和200 mg/kg茶多酚組增重率有提高的趨勢(shì)，而400、600和800 mg/kg茶多酚組增重率有降低的趨勢(shì)，且800 mg/kg茶多酚組的增重率較200 mg/kg茶多酚組顯著降低(P<0.05)。以增重率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出奧尼羅非魚(yú)增重率(y)與茶多酚添加量(x)之間的一元二次回歸方程為y=-0.000 3x2+0.122 4x+1 500(R2=0.508 4)，由回歸方程得出，當(dāng)茶多酚添加量為204 mg/kg時(shí)，奧尼羅非魚(yú)具有最高的增重率。在形體指標(biāo)方面，600和800 mg/kg茶多酚組奧尼羅非魚(yú)的肝體指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；肥滿度和臟體指數(shù)各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)和形體指標(biāo)的影響Table 2 Effects of TP on growth and physical indexes of hybrid tilapia

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)體成分的影響

茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)體成分的影響見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，飼料中添加600、800 mg/kg茶多酚顯著降低了全魚(yú)粗脂肪含量(P<0.05)。全魚(yú)水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性的影響

茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性的影響見(jiàn)表4。隨著飼料中茶多酚添加量的增加，干物質(zhì)表觀消化率呈現(xiàn)先增加后降低的規(guī)律，在200 mg/kg茶多酚組顯著高于其他組(P<0.05)；粗蛋白質(zhì)表觀消化率不受茶多酚添加量的顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，高添加量(600、800 mg/kg)的茶多酚顯著降低了腸道蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)。

2.4 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響

茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響見(jiàn)表5。與對(duì)照組相比，飼料中添加200、400、600和800 mg/kg茶多酚均顯著增加了血清SOD和LZM活性(P<0.05)。二次曲線回歸分析表明，茶多酚添加量為438.89、412.35 mg/kg時(shí)，血清SOD和LZM活性分別最高(圖1)。血清MDA含量隨茶多酚添加量的增加表現(xiàn)出先降低后升高的規(guī)律，其中在200 mg/kg茶多酚組具有最小值。血清AKP活性各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)體成分的影響(濕重基礎(chǔ))Table 3 Effects of TP on body composition of hybrid tilapia (wet weight basis) %

表4 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性的影響Table 4 Effects of TP on nutrient apparent digestibility and intestinal digestive enzyme activities of hybrid tilapia

表5 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of TP on serum immunological indexes of hybrid tilapia

圖1 血清SOD或LZM活性與茶多酚添加量的關(guān)系Fig.1 Relationships between TP supplemental level and serum SOD or LZM activities

2.5 茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌攻毒后奧尼羅非魚(yú)累積死亡率的影響

由圖2可見(jiàn)，攻毒后1 h，各組試驗(yàn)魚(yú)均無(wú)死亡(存活率為100%)；攻毒后24 h，100、200、400和600 mg/kg茶多酚組的累積死亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；攻毒后48和96 h，200、400、600和800 mg/kg茶多酚組的累積死亡率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中400 mg/kg茶多酚組累積死亡率最低。

相同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。
Data points at the same time point with different small letters mean significant difference (P<0.05).
圖2茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌攻毒后奧尼羅非魚(yú)累積死亡率的影響
Fig.2 Effects of TP on cumulative mortality of hybrid tilapia challenged withAeromonashydrophila

3 討 論

3.1 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)和消化功能的影響

茶多酚在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加50～100 mg/kg茶多酚，顯著提高了團(tuán)頭魴的增重率和特定生長(zhǎng)率，上調(diào)了生長(zhǎng)相關(guān)基因MaGHR2的表達(dá)[8]；飼料中添加50～100 mg/kg茶多酚后，在數(shù)值上提高了虹鱒的增重率，但差異未達(dá)顯著水平[6]。在羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)的試驗(yàn)中，飼料中添加166 mg/kg茶多酚顯著提高了魚(yú)體的增重率，但添加333 mg/kg茶多酚未對(duì)生長(zhǎng)性能產(chǎn)生有益影響[14]。同樣地，飼料中添加50 mg/kg茶多酚顯著提高了青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)的特定生長(zhǎng)率，而添加500 mg/kg茶多酚顯著降低了青魚(yú)的特定生長(zhǎng)率[15]。本試驗(yàn)在飼料中添加100～800 mg/kg茶多酚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但100、200 mg/kg茶多酚有提高增重率的趨勢(shì)，而400、600和800 mg/kg茶多酚有降低增重率的趨勢(shì)，且800 mg/kg茶多酚組的增重率較200 mg/kg茶多酚組顯著降低。這表明，高添加量的茶多酚對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)可能具有抑制作用。Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中綠茶渣添加量超過(guò)3.6%時(shí)，羅非魚(yú)的增重率降低，飼料系數(shù)增加。Welker等[17]也發(fā)現(xiàn)，虹鱒攝食含4%綠茶的飼料后，增重率顯著降低，飼料系數(shù)顯著升高，這可能也是高添加量的茶多酚所致。茶多酚是從茶葉中提取的酚類(lèi)化合物，而酚類(lèi)化合物通常被認(rèn)為是飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率和動(dòng)物生長(zhǎng)性能[18-19]。

本試驗(yàn)中，添加100～400 mg/kg茶多酚顯著增加了奧尼羅非魚(yú)的干物質(zhì)表觀消化率，但高添加量(600、800 mg/kg)的茶多酚則顯著降低了干物質(zhì)表觀消化率，腸道淀粉酶和蛋白酶活性。在青魚(yú)飼料中添加50 mg/kg茶多酚，腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著增加，而添加500 mg/kg茶多酚后，腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著降低[15]。在小鼠飼糧中添加0.4%茶多酚后發(fā)現(xiàn)顯著降低了粗蛋白質(zhì)表觀消化率[20]，用0.4%茶多酚灌喂小鼠后，腸道對(duì)水分、葡萄糖、膽固醇、氨基酸和礦物質(zhì)的消化率顯著降低[21]。茶多酚能夠緩解腸道氧化應(yīng)激，促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)[22]，這有利于提高動(dòng)物的消化吸收功能；但過(guò)量的茶多酚可能像其他多酚類(lèi)物質(zhì)一樣，能夠與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)物質(zhì)和礦物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而降低其消化率[23-25]。關(guān)于茶多酚影響魚(yú)類(lèi)消化吸收功能的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

3.2 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)體成分的影響

茶多酚可通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)激素如胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ、瘦素和脂聯(lián)素等的含量和脂肪代謝相關(guān)信號(hào)通路基因的表達(dá)，降低攝食高脂飼糧小鼠的體脂肪含量[26-28]。分別灌喂80、160 mg/kg茶多酚后，肉雞皮下脂肪厚度、肌間脂肪寬度和腹脂率均顯著降低[29]。飼料中添加6.4%的綠茶渣顯著降低了羅非魚(yú)全魚(yú)粗脂肪含量，而全魚(yú)水分、粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著差異[16]。本試驗(yàn)結(jié)果與之類(lèi)似，飼料中添加茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)全魚(yú)水分和粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著影響，但是高添加量(600、800 mg/kg)的茶多酚顯著降低了全魚(yú)粗脂肪含量。這在虹鱒上也有類(lèi)似報(bào)道，即低添加量(25～500 mg/kg)的茶多酚對(duì)全魚(yú)粗脂肪含量無(wú)顯著影響，但高添加量(1 000 mg/kg)的茶多酚顯著降低了全魚(yú)粗脂肪含量[6]。在低添加量(25、50 mg/kg)條件下，茶多酚提高了團(tuán)頭魴幼魚(yú)肌肉粗蛋白質(zhì)含量，但是對(duì)肌肉粗脂肪含量無(wú)顯著影響[8]?？梢?jiàn)，茶多酚對(duì)魚(yú)類(lèi)體脂沉積的影響與茶多酚的添加量有關(guān)，高添加量的茶多酚通常會(huì)抑制脂肪在魚(yú)體的沉積。

3.3 茶多酚對(duì)奧尼羅非魚(yú)免疫性能和抗病力的影響

4 結(jié) 論

① 飼料中添加200 mg/kg茶多酚具有促進(jìn)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)的趨勢(shì)。

② 飼料中添加400 mg/kg茶多酚可增加奧尼羅非魚(yú)的免疫性能，降低嗜水氣單胞菌攻毒后的累積死亡率。

③ 在本試驗(yàn)條件下，奧尼羅非魚(yú)飼料中茶多酚的建議添加量為200～400 mg/kg。