于 妍，楊阿妮

甘肅省中醫(yī)院心血管病科，甘肅 蘭州 730050

目前動脈粥樣硬化(AS)性疾病的發(fā)病率及死亡率逐年上升，并呈年輕化趨勢［1］。AS不穩(wěn)定斑塊破裂所形成的急性血栓是心血管惡性事件發(fā)生的主要原因［2］。有研究［3］表明，炎性因子貫穿粥樣斑塊形成的開始、過程和最終破裂的全過程。C-反應(yīng)蛋白(CRP)是一種重要的心血管炎性標(biāo)志物，相關(guān)研究［4］發(fā)現(xiàn)，CRP在斑塊破裂、不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是由炎癥細(xì)胞分泌的可降解基質(zhì)的蛋白酶，其具有促進(jìn)粥樣斑塊纖維帽中基質(zhì)成分降解的作用，從而加速斑塊破裂?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是MMPs家族中的重要成員,在粥樣斑塊處的血管重構(gòu)、斑塊的不穩(wěn)定及其破裂中扮演著重要角色［5］。近年研究［6］發(fā)現(xiàn)，斑塊內(nèi)新生血管形成與As斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，As斑塊內(nèi)常出現(xiàn)病理性新生血管，它們可能促進(jìn)粥樣硬化病變的發(fā)展，甚至誘發(fā)斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂及其并發(fā)癥的發(fā)生。

本研究“以方測證”，觀察芪烏調(diào)脂顆粒對炎癥因子、MMPs、VEGF的影響，及對維持斑塊穩(wěn)定性的作用，為中醫(yī)藥防治AS的作用環(huán)節(jié)和作用靶點提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗藥品芪烏調(diào)脂顆粒(生黃芪、制首烏、澤瀉、郁金、生山楂、決明子、片姜黃、水蛭等組成，每包含生藥6 g，由甘肅省中醫(yī)院制劑科制備，登記號：2013Y0228)；阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號：130127，10 mg/片)。

1.2實驗動物健康SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：醫(yī)動字第0000852號。

1.3實驗試劑膽固醇(上海伯奧生物科技有限公司，批號：20130122)；膽酸鈉(上海源聚生物科技有限公司，批號：20131102)；丙基硫氧嘧啶(南通制藥總廠，批號：130514)；超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)ELISA試劑盒［尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司，批號：20131207］；兔抗鼠 MMP-9(產(chǎn)品編號：AW0219，批號：20130324)，兔抗鼠 VEGF(產(chǎn)品編號：BA0407，批號：20130315)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(產(chǎn)品編號：AR1022，批號：20130223)，牛血清白蛋白(BSA)封閉液(產(chǎn)品編號：DS0619，批號：20130315)，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4實驗儀器Tissue-Tek.VIPTM5Jr全封閉組織脫水機(jī)(日本，櫻花檢驗儀器株式會社)；Tissue-Tek.TECTM5組織包埋機(jī)(日本，櫻花)；AO型切片機(jī)(美國，賽默飛)；OLMPUSCHC-212型雙目生物顯微鏡(日本，奧林巴斯)；ALCYON300全自動酶標(biāo)儀(美國，雅培)；LD4-2A型高速臺式冷凍離心機(jī)(中國，北京京立)；PYX-DHS-50×60型隔水恒溫培養(yǎng)箱(中國，上海躍進(jìn))；WKY型 5-25 μL型微量移液器(中國，上海榮泰)；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(中國，成都泰盟)。

1.5實驗方法

1.5.1 動物分組與給藥 健康SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組16只，分別為：空白組(生理鹽水)；模型組(生理鹽水)；芪烏調(diào)脂顆粒組(芪烏調(diào)脂顆粒3 g/kg，相當(dāng)于臨床用量10倍)；阿托伐他汀組(阿托伐他汀1.7 mg/kg，相當(dāng)于臨床用量10倍)；芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組(芪烏調(diào)脂顆粒3 g/kg+阿托伐他汀1.7 mg/kg，相當(dāng)于臨床用量10倍)；造模成功后將上述藥物按10 mL/kg灌胃給藥，1次/d，連續(xù)8周。

1.5.2 模型制備及取材 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模，模型組、芪烏調(diào)脂顆粒組、阿托伐他汀組、芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組(芪烏+阿托組)給予高脂飼料(81.3%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%白糖、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶)，同時腹腔注射維生素D3注射液60萬U/kg，分3天完成；空白組給予基礎(chǔ)飼料(麩皮25%、面粉20%、豆料20%、玉米 20%、米粉 10%、骨粉 3%、魚粉 2%)，同時腹腔注射等容量生理鹽水，分3天完成。4周后從模型組和空白組各取2只處死，用于檢驗造模是否成功。

末次給藥后大鼠禁食不禁水，24小時后各組大鼠采靜脈血2 mL，測定血脂各項。股動脈取血2 mL，全血在6 000 r/min條件下離心5分鐘，取血清測定hs-CRP。將大鼠脫頸處死后取主動脈組織置于10%甲醛溶液中，待檢。

1.6指標(biāo)檢測

1.6.1 各項檢測指標(biāo) 采用酶法測定甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.6.2 光鏡檢查主動脈病理形態(tài)切片 用10%甲醛固定主動脈血管，脫水，石蠟包埋；將石蠟包埋的組織用病理切片機(jī)切成厚5 μm石蠟切片；脫蠟、水化；HE染色。

1.6.3 血清hs-CRP的測定 采用ELISA法測定大鼠血清中hs-CRP含量，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定OD值，根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度。

1.6.4 SABC法檢測主動脈組織切片中MMP-9、VEGF的表達(dá) 石蠟切片滴加3%H2O2，室溫靜置5～10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸15～20分鐘，室溫冷卻 20～30 分鐘，PBS(pH 7.2～7.6)液洗滌3分鐘×3次；滴加5%BSA封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，不洗；滴加一抗(兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠VEGF)，37℃1小時左右，PBS(pH 7.2～7.6)沖洗，3分鐘×3次；滴加生物素二抗工作液，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗3分鐘×3次；滴加試劑SABC，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗，5分鐘×4次。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，自來水沖洗中止反應(yīng)；逐級脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；顯微鏡觀察；計算機(jī)圖像掃描半定量分析陽性信號的表達(dá)(VEGF，MMP-9以灰度值表示)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般狀況各組大鼠入組時毛色白、順滑有光澤，目紅有神，對聲、光、捕捉等刺激敏感。至實驗結(jié)束時，空白組與入組時差別不大，體質(zhì)量平均增長20%左右；模型組大鼠毛色暗黃，精神萎靡，飲食、活動少，對外界刺激反應(yīng)差，平均體質(zhì)量下降15%左右；芪烏調(diào)脂顆粒組、芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組、阿托伐他汀組大鼠較模型組毛色白，活動、飲食量增加，體質(zhì)量較模型組略回升。

2.2對血脂的影響1)與空白組相比，模型組TC、TG、LDL-C水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；2)與模型組相比，芪烏調(diào)脂顆粒組、芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組、阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。落，內(nèi)皮下間隙增寬，內(nèi)彈力層和中彈力板發(fā)生變性、斷裂和崩解，內(nèi)膜和中膜均出現(xiàn)大量斑塊和炎細(xì)胞浸潤；中膜明顯增厚，且有鈣化和泡沫細(xì)胞形成，SMC增殖明顯，排列顯著紊亂；外膜可見炎細(xì)胞浸潤，見圖1。

表1 各組大鼠TC、TG、LD L-C變化情況(±s) mg/dl

表1 各組大鼠TC、TG、LD L-C變化情況(±s) mg/dl

注：＊表示與空白組比較，P＜0.05；△表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) TC TG LDL-C空白組 16 154.55±8.44 101.21±19.89 86.32±6.07模型組 16 178.91±13.41＊ 123.57±23.93＊ 111.14±10.72＊芪烏調(diào)脂顆粒組 16 148.24±15.22△ 106.76±20.92△ 81.57±9.28△芪烏+阿托組 16 145.05±13.65△ 102.09±23.39△ 80.33±6.58△阿托伐他汀組 16 146.32±14.82△ 104.13±21.22△ 82.40±7.62△

2.3.3 芪烏調(diào)脂顆粒組 內(nèi)膜增厚隆起厚薄不一，內(nèi)皮細(xì)胞不完整，可見脫落細(xì)胞及遷移的SMC，但較模型組明顯減輕；中膜SMC增殖，內(nèi)見少量泡沫細(xì)胞，多灶性鈣化，較對照組顯著增厚，但較模型組略變??；外膜可見少量炎細(xì)胞浸潤，見圖1。

2.3.4 芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀鈣組 主動脈壁層次尚清晰，內(nèi)彈力板基本完整，內(nèi)膜較薄，且較均勻，輕微隆起，未見脫落細(xì)胞，內(nèi)膜下可見SMC增生，較模型組明顯減輕，中膜層較對照組顯著增厚，但較模型組明顯減輕，結(jié)締組織和平滑肌細(xì)胞內(nèi)見少量泡沫細(xì)胞聚集，外膜為疏松結(jié)締組織，見圖1。

2.3.5 阿托伐他汀組 內(nèi)膜厚薄不一，內(nèi)皮細(xì)胞不完整，內(nèi)皮下間隙增寬，可見遷移的SMC和泡沫細(xì)胞；中膜SMC增殖，有少量淋巴細(xì)胞和泡沫細(xì)胞，內(nèi)皮下有少量壞死物，較模型組明顯減輕；外膜可見少量炎細(xì)胞浸潤，見圖1。

2.3對主動脈病理形態(tài)學(xué)的影響

2.3.1 空白組 大鼠主動脈壁各層結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚，內(nèi)皮細(xì)胞完整，管腔內(nèi)膜光滑無增生，厚薄均勻，中膜彈力纖維正常，SMC排列整齊規(guī)則無增殖遷移，外膜無炎性細(xì)胞浸潤，見圖1。

2.3.2 模型組 主動脈管腔變小，內(nèi)膜薄厚不一，可見內(nèi)皮細(xì)胞脫

圖1 大鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE，10×40倍)

2.4各組大鼠血清hs-CRP1)與空白組相比，模型組大鼠血清hs-CRP水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；2)與模型組相比，阿托伐他汀組、芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組血清hs-CRP顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；3)與阿托伐他汀組相比，芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組血清hs-CRP降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清hs-CRP水平(±s)

表2 各組大鼠血清hs-CRP水平(±s)

注：＊表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與阿托伐他汀組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) hs-CRP/(μg·mL-1)空白組 16 173.08±7.97模型組 16 350.22±51.27＊芪烏調(diào)脂顆粒組 16 301.61±22.62芪烏+阿托組 16 209.13±21.04△#阿托伐他汀組 16 243.69±21.74△

2.5對主動脈組織V EG F、M M P-9的影響

2.5.1 各組大鼠心肌組織中MMP-9免疫組化結(jié)果 空白組棕黃色顆粒極少，為弱陽性表達(dá)，模型組可見大片棕黃色顆粒，為強(qiáng)陽性表達(dá)，與模型組比較各治療組胞漿中的陽性顆粒均有減少。1)與空白組比較，模型組MMP-9陽性表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；2)與模型組比較，阿托伐他汀組、芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組MMP-9表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。3)與阿托伐他汀組比較，芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組降低MMP-9陽性表達(dá)明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表 3、圖 2。

表3 芪烏調(diào)脂顆粒對大鼠M M P-9的影響(±s)

表3 芪烏調(diào)脂顆粒對大鼠M M P-9的影響(±s)

注：＊表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與阿托伐他汀組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) MMP-9(灰度值)空白組 16 61.36±3.00模型組 16 143.22±3.58＊芪烏調(diào)脂顆粒組 16 131.38±3.71△#芪烏+阿托組 16 100.69±5.17阿托伐他汀組 16 112.18±5.63△

圖2 大鼠主動脈組織MMP-9免疫組化結(jié)果(10×40倍)

2.5.2 各組大鼠主動脈VEGF免疫組化結(jié)果 空白組棕黃色顆粒極少，為弱陽性或陰性表達(dá)，模型組可見大片黃色顆粒，為強(qiáng)陽性表達(dá)，與模型組相比各治療組胞漿中的陽性顆粒均減少。1)與空白組比較，模型組VEGF陽性表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；2)與模型組比較，芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組VEGF表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；3)與阿托伐他汀組相比，芪烏調(diào)脂顆粒+阿托伐他汀組降低VEGF顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表 4，圖 3。

表4 芪烏調(diào)脂顆粒對大鼠V EG F的影響(±s)

表4 芪烏調(diào)脂顆粒對大鼠V EG F的影響(±s)

注：＊表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與阿托伐他汀組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) VEGF(灰度值)空白組 16 98.71±3.05模型組 16 131.99±5.40＊芪烏調(diào)脂顆粒組 16 126.55±3.15△#芪烏+阿托組 16 104.20±5.34阿托伐他汀組 16 123.63±2.45

圖3 大鼠主動脈組織VEGF免疫組化結(jié)果(10×40倍)

3 討論

AS是動脈硬化性血管病中最常見、最重要的一種疾病，是冠心病、腦血管病等缺血性疾病的主要病理基礎(chǔ)［7］。動脈粥樣硬化的形成機(jī)制復(fù)雜，有研究［8］顯示與脂質(zhì)浸潤、炎癥反應(yīng)、血管新生因素等有關(guān)，且炎癥反應(yīng)、血管新生與不穩(wěn)定斑塊的破裂密切相關(guān)。因此，降脂有利于預(yù)防、減緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程，抗炎、抑制血管新生有利于穩(wěn)定斑塊、預(yù)防斑塊破裂而導(dǎo)致的急性心腦血管事件［9］。

動脈粥樣硬化性疾病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“眩暈”“胸痹”等范疇。其病機(jī)總屬本虛標(biāo)實，本虛主要表現(xiàn)為氣虛，標(biāo)實主要為痰濁血瘀。芪烏調(diào)脂顆粒以中醫(yī)理論為依據(jù)，發(fā)揮辨病與辨證相結(jié)合的優(yōu)勢，以益氣、活血、排濁為法，方中重用黃芪補(bǔ)氣行血，何首烏補(bǔ)腎泄?jié)?，山楂散瘀降濁，水蛭活血破瘀，諸藥合用，共奏攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本同治之功效，使元氣旺血行暢，瘀血祛痰濁除，則脈絡(luò)通。

本研究結(jié)果表明，芪烏調(diào)脂顆粒能夠降低AS模型大鼠血脂，并降低模型大鼠血清中的hs-CRP的含量及MMP-9、VEGF的表達(dá)，與阿托伐他汀鈣有協(xié)同治療作用，從而影響AS大鼠的預(yù)后。從動物驗?zāi)Ｐ徒嵌日撟C了芪烏調(diào)脂顆粒是一種有效、安全的調(diào)脂中成藥，同時具有一定的抗炎、降低病理性血管新生的作用。