眾所周知，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的發(fā)生是一個(gè)多因素作用的結(jié)果，包括遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激和炎癥等在內(nèi)多種因素可能參與了AD的發(fā)生[1]。在這些因素中，β淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷和死亡是AD發(fā)生的主要原因之一[2]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是機(jī)體氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的主要分子。Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS能夠?qū)Ω鞣N生物分子的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害，引起DNA裂解、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能異常和凋亡[3]。因此，減少Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是AD潛在的一種治療方法。

青蒿素(Artemisinin)，一種倍半萜內(nèi)酯，最初有中國科學(xué)家從青蒿中分離出的一種藥物[4]。其被廣泛用于瘧疾的治療，是目前最有效治療瘧疾的藥物。除此之外，不斷地有研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿素還具有抗炎[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗腫瘤[7]和神經(jīng)保護(hù)[8]等作用。然而，青蒿素是否在Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞毒性作用中具有保護(hù)性作用及其可能的分子機(jī)制，目前尚缺乏相關(guān)的研究。本研究將對上述內(nèi)容進(jìn)行研究，以期能夠?yàn)锳rtemisinin在AD的防治方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SH-SY5Y細(xì)胞株購買自中科院細(xì)胞庫;血清、DMEM培養(yǎng)基和青-鏈霉素雙抗購自Hyclone公司;Artemisinin和Aβ1-42購買自美國Sigma公司;Nrf2、HO-1、Lamin B1和GAPDH抗體購買自英國Abcam公司;ROS檢測熒光探針dihydroethidium(DHE)、MTT試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、PMSF 蛋白酶抑制劑、封閉液、一抗和二抗稀釋液均購買自碧云天生物技術(shù)公司;HRP標(biāo)記的抗兔二抗、抗鼠二抗均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司;ECL發(fā)光試劑和PVDF膜購買自美國Millipore公司;

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)在包含10%血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)裝置為37 ℃含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 (1)使用不同濃度(0.1% DMSO、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的Aβ1-42處理SH-SY5Y 細(xì)胞24 h后，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力，LDH細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的受損情況。(2)使用不同濃度(0.1% DMSO、0 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L、24 μmol/L、48 μmol/L和96 μmol/L)的Artemisinin處理SH-SY5Y 細(xì)胞1 h后，然后加入Aβ1-42使其濃度為5 μmol/L，培養(yǎng)24 h后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力，LDH實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的受損情況。(3)SH-SY5Y細(xì)胞分為control、Aβ1-42組，control + Aβ1-42組和Artemisinin + Aβ1-42。培養(yǎng)24 h后，通過DHE熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Western blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞活力 SH-SY5Y細(xì)胞(3×104/每孔)被接種在96孔中，根據(jù)研究目的不同，加入不同藥物處理24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)3 h后。棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μl的DMSO。充分震蕩后，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在570 nm下的吸光值并記錄，每組設(shè)6個(gè)復(fù)空。

1.2.4 ROS的檢測 SH-SY5Y細(xì)胞被接種在6孔中，根據(jù)研究目的不同，加入不同藥物處理24 h后，將各組細(xì)胞加入DHE溶液使其終濃度為5 μmol/L，然后在培養(yǎng)箱孵育30 min。PBS漂洗3次，在熒光顯微鏡下檢測。

1.2.5 LDH的檢測 當(dāng)細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，這其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)。通過檢測培養(yǎng)液中的LDH的活性，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞毒性的定量分析，從而在一定程度上反映了細(xì)胞的受損情況。

1.2.6 Western blotting檢測Nrf2和HO-1的表達(dá) SH-SY5Y細(xì)胞被接種在6孔中，根據(jù)研究目的不同，加入不同藥物處理24 h后。將各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，然后每組加入100 μl的裂解液并在冰上裂解30 min。隨后刮去蛋白、離心和BCA法定量檢測。配制10% SDS聚丙烯酰氨凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和抗體孵育。次日使用ECL液進(jìn)行顯影，通過Image J軟件對條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的Aβ1-42對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用 使用不同濃度的(0.1% DMSO、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)Aβ1-42的處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度Aβ1-42的對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響。MTT結(jié)果表明：與control組相比，隨著Aβ1-42的濃度的增加，細(xì)胞的活力不斷被抑制(P<0.001)(見圖1A)。相似地，LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：與control相比，隨著Aβ1-42的濃度的增加，其對細(xì)胞的毒性作用也不斷增加，表明細(xì)胞的凋亡數(shù)也不斷增加(P<0.001)(見圖1B)。

Control表示對照組，對照組用0.1% DMSO處理，與Control組相比***P<0.001

圖1 不同濃度的Aβ1-42對細(xì)胞的毒性作用

2.2 Artemisinin減弱Aβ1-42對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用 使用不同濃度的(0.1% DMSO、0 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L、24 μmol/L、48 μmol/L和96 μmol/L)Artemisinin處理SH-SY5Y細(xì)胞1 h后，每組加入Aβ1-42使其最終濃度為5 μmol/L，兩種藥物共同處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行MTT和LDH檢測。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著Artemisinin的濃度的增加，Aβ1-42對細(xì)胞的活力抑制作用不斷被減弱;在Artemisinin濃度為24 μmol/L時(shí)，作用效果最明顯(P<0.001)(見圖2A)。與上述結(jié)果相一致，LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：隨著Artemisinin的濃度的增加，Aβ1-42對細(xì)胞的毒性作用不斷被減弱，對細(xì)胞的促凋亡作用不斷被抑制;在Artemisinin濃度為24 μmol/L時(shí)，作用效果最顯著(P<0.001)(見圖2B)。

Control表示對照組，對照組用0.1% DMSO處理;與不加Artemisinin處理組相比***P<0.001

圖2 Artemisinin對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

2.3 Artemisinin抑制Aβ1-42在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 將SH-SY5Y細(xì)胞分為以下4組：control組、5 μmol/L Aβ1-42組、control + 5 μmol/L Aβ1-42組和24 μmol/L Artemisinin + 5 μmol/L Aβ1-42組，各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，通過DHE探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，來了解細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激情況。免疫熒光結(jié)果統(tǒng)計(jì)表明：與control組相比，Aβ1-42處理明顯增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平(P<0.001)(見圖3);與control + Aβ1-42組相比，Artemisinin顯著抑制了Aβ1-42誘導(dǎo)的ROS的表達(dá)(P<0.001)(見圖3)。這些結(jié)果表明：Artemisinin能夠抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

2.4 Artemisinin上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá) 將SH-SY5Y細(xì)胞分為以下4組：control組、5 μmol/L Aβ1-42組、control + 5 μmol/L Aβ1-42組和24 μmol/L Artemisinin + 5 μmol/L Aβ1-42組，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，通過Western blotting檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與control + Aβ1-42組相比，Artemisinin顯著抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2的表達(dá)，促進(jìn)HO-1和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)(見圖4)。

Control表示對照組，對照組用0.1% DMSO處理***P<0.001

Control表示對照組，對照組用0.1% DMSO處理

3 討 論

AD是一種常見的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，患者常表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和記憶退化。眾所周知，Aβ的異常聚集是AD最顯著的特點(diǎn)，與AD的發(fā)生密切相關(guān)。大量積累的Aβ不僅能夠?qū)е吕夏臧叩男纬?，而且還可以導(dǎo)致線粒體功能異常，這些異常包括能量代謝紊亂、線粒體去極化和氧化應(yīng)激等。氧化應(yīng)激是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵機(jī)制之一;氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的大量ROS可以直接或間接損害細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)的功能。而且，研究還證實(shí)：氧化應(yīng)激是許多退行性疾病最主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，這其中就包括AD[9]。因此，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致AD發(fā)生的主要原因之一，也是其潛在的治療靶點(diǎn)[10]。目前，已有大量的研究發(fā)現(xiàn)：包括姜黃素[11]、維生素E[12]和白藜蘆醇[13]在內(nèi)的多種抗氧化藥物具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減弱Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用和促凋亡作用。

Artemisinin是一種廣泛用于瘧疾治療的藥物。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)Artemisinin具有抗氧化作用，其對神經(jīng)細(xì)胞PC12具有營養(yǎng)和保護(hù)作用[8，14]。除此之外，Zeng等[15]也報(bào)道：Artemisinin能夠通過ERK1/2通路抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，并指出Artemisinin有希望用于AD的防治。和上述結(jié)果相一致，在我們目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Aβ1-42能夠以濃度依賴的方式抑制SH-SY5Y細(xì)胞的活力，促進(jìn)其凋亡;Artemisinin能夠減輕Aβ1-42對SH-SY5Y細(xì)胞活力的抑制，抑制Aβ1-42對 SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。我們進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)：Artemisinin能夠減少Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

對于Artemisinin抑制Aβ1-42在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的分子機(jī)制，目前尚缺乏相關(guān)的報(bào)道。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子 2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，參與激活多種與細(xì)胞保護(hù)和解毒相關(guān)基因的表達(dá)。在氧化應(yīng)激條件下Nrf2將被激活，這將導(dǎo)致Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，然后結(jié)合到抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)上，從而激活I(lǐng)I相解毒酶和抗氧化酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這其中就包括血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)[16]。而之前的研究已經(jīng)證實(shí)：HO-1在 Aβ對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用過程中具有保護(hù)作用[17]。除此之外，多項(xiàng)研究還表明：激活的Nrf2對神經(jīng)退行性疾病具有保護(hù)作用，其有可能成為那些發(fā)病與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)[18]。因此，這些都促使我們在本研究中調(diào)查Artemisinin對Nrf2和HO-1表達(dá)的影響。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Artemisinin能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)，抑制胞質(zhì)內(nèi)Nrf2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)其下游靶基因HO-1的表達(dá)。巧合的是，之前的研究也發(fā)現(xiàn)，Artemether(一種青蒿素的衍生物)能夠通過上調(diào)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV2中Nrf2和HO-1的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)炎癥[19]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Artemisinin在Aβ1-42誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用過程中具有保護(hù)作用，其有可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮上述作用。期望我們的研究結(jié)果為Artemisinin應(yīng)用于AD的治療提供理論依據(jù)。