曾小玲，黃建都，謝鑫鑫，祝金虹

（1.福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建 福州 350111；2.武夷山市土肥技術(shù)站，福建 武夷山 354300）

蘿卜（Raphanus sativusL.）又稱萊菔，十字花科蘿卜屬，是我國最主要的根菜類蔬菜。采用雜種優(yōu)勢選育出綜合性狀優(yōu)良的雜種一代是一種有效的育種手段。雜交育種通常是參照親本性狀的表現(xiàn)區(qū)別從而做出許多的組合配制，并且參照配合力而進行判斷，組合比較試驗可淘汰大部分的組合，選出少數(shù)優(yōu)勢強的組合，但常規(guī)育種方法受環(huán)境的影響大，人力物力耗費大，時間長，且效果很差。通過運用DNA分子標(biāo)記親本間遺傳距離預(yù)測雜種優(yōu)勢的類似研究已經(jīng)在玉米等多種作物[1-10]上進行，這將成為一種有效的育種手段之一。相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）標(biāo)記具有操作簡單、多態(tài)性高、重復(fù)性好等[11]特點，在不同作物[12-14]遺傳多樣性分析中被應(yīng)用，包括應(yīng)用于蘿卜的遺傳多樣性分析[15]、抽薹性狀的分析[16]和種質(zhì)資源指紋圖譜分析[17]。本研究應(yīng)用SRAP標(biāo)記技術(shù)和蘿卜產(chǎn)量性狀[18]表型數(shù)據(jù)，通過解析蘿卜親本間遺傳距離與雜交組合雜種優(yōu)勢的相關(guān)性，以尋找運用SRAP標(biāo)記遺傳距離預(yù)測蘿卜雜種優(yōu)勢的可行性，為加快蘿卜雜交種選育提供參考。

表1 供試材料及來源

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為福州市蔬菜科學(xué)研究所蘿卜課題組育成的高代耐寒自交不親和系11份，其中母本5份，分別是4-2H-4-1、13-2H-1、6-2H-2、24-1-8、20-9-3-5，父本6份，分別是39-3H-1、40-2H-2、18-2-2H-2、57-10-3-1H、9-3-1H、31-1H-1-3，具體見表1。按照NCⅡ不完全雙列雜交設(shè)計，組配成1套包括11個親本和30個F1的2個世代的材料。

1.2 田間試驗設(shè)計

2015年10月中旬直播于長樂市石壁村試驗地，包括11個親本、30個組合、白龍春（CK）共42個材料，隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，小區(qū)面積1.2 m×3.5 m，常規(guī)栽培管理。收獲期，每小區(qū)隨機取樣10株進行考種，考查根長、株高、葉片數(shù)、外露長、葉片長、葉片質(zhì)量6個農(nóng)藝性狀。

1.3 SRAP標(biāo)記檢測

1.3.1 基因組DNA的提取

采用CTAB提取法提取蘿卜總DNA。取4片真葉時的蘿卜嫩葉0.2 g，放入研缽中，加液氮迅速研磨成細末后，快速移入已經(jīng)預(yù)熱的含2×CTAB 600 μL、β-巰基乙醇5 μL提取緩沖液的1.5 mL離心管中，充分混勻，65 ℃溫浴15 min；常溫下12 000 r/min離心10 min；取上清600 μL，加入等體積的酚︰氯仿︰異戊醇混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min析出DNA沉淀，去上清；用70%乙醇，將DNA懸浮洗滌；4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清，吹干后將DNA溶解于ddH2O中，置于-20 ℃保存。

1.3.2 SRAP的PCR擴增與檢測

SRAP引物參照Zhang等[19]的報道，由生工生物（上海）股份有限公司合成。其中的1 3條正向引物以及1 6條反向引物依次為：me1～me13/em1～em16，2種不同的引物共組合成208個引物對。SRAP-PCR擴增體系為20 μL：30 ng模板DNA，2 μL的10×Buffer，0.4 μL的10 mmol/L dNTP，5 μmol/L的正反向引物各1 μL，0.2 μL的Taq，補水至20 μL。擴增程序參照繆體云等[20]的方法并稍作修改：94 ℃預(yù)變性3.5 min；94 ℃變性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR的擴增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為1×TAE。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 親本間分子遺傳距離

根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在電泳圖譜上將同一引物對、同一位點有DNA擴增帶記為1，同一位置上無帶記為0，形成0，1矩陣。

通過NTSYS 2.1統(tǒng)計分析軟件計算任意2個材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）與遺傳距離（GD），計算公式為GS=2Nab/（Na+Nb），GD=1－GS；公式中，Nab代表材料a與b共有的擴增條帶總數(shù)，Na、Nb依次代表材料a和b中顯示的擴增條帶數(shù)量。

1.4.2 雜種優(yōu)勢

用常規(guī)考種方法，測定田間親本與雜種一代的根長、株高、葉片數(shù)、展開度、葉片長、根粗等農(nóng)藝性狀，從而計算出雜種優(yōu)勢。雜種優(yōu)勢計算方法為：中親優(yōu)勢=（F值－雙親平均值）/雙親平均值×100%；高親優(yōu)勢=（F值－高親值）/高親值×100%；公式中，F(xiàn)值代表主要產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀平均值，即將每個組合的優(yōu)勢累加和除總組合數(shù)；雙親平均值代表雙親同一性狀平均值；高親值代表高值親本同一性狀平均值。將雙親SRAP標(biāo)記分子遺傳距離與F值、中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢值進行相關(guān)分析，用分子標(biāo)記遺傳距離預(yù)測F1的產(chǎn)量性狀表現(xiàn)以及雜種優(yōu)勢的強弱。以上試驗結(jié)果的計算與分析在DPS 7.05與Excel軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜主要農(nóng)藝性狀的遺傳變異

通過對11個親本中的6個產(chǎn)量相關(guān)性狀進行遺傳變異分析（表2），其中供試親本6個農(nóng)藝性狀的F值（平均值）均達到了極顯著水平，這說明供試的11個親本在6個農(nóng)藝性狀上彼此間都存在極顯著的遺傳差異。通過變異系數(shù)大小又不難發(fā)現(xiàn)，供試親本間葉片長度與葉片質(zhì)量的變異最明顯，變異系數(shù)分別為0.31與0.34；而株高的變異最小，變異系數(shù)為0.16。表明多數(shù)形態(tài)性狀上存在顯著或極顯著差異。

2.2 SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性比較

選擇208對SRAP引物組合分別對11個親本進行PCR擴增，結(jié)果從中分別篩選出親本間含多態(tài)性的SRAP引物共53對。53對SRAP多態(tài)性引物一共擴增出896條清晰條帶，然而每對引物組合產(chǎn)生5～29條擴增帶，平均有14.2條，呈現(xiàn)出多態(tài)性的譜帶數(shù)目共有327條，該數(shù)量占總條帶數(shù)的36.5%；其中，每1對引物組合都產(chǎn)生1～15條多態(tài)性帶，平均為5.2條，相當(dāng)于平均檢測到5.2個等位基因。

2.3 SRAP標(biāo)記估算的親本間遺傳距離比較

通過觀察SRAP標(biāo)記結(jié)果，分別估算11個親本間的遺傳距離GD（表3）。其中，SRAP標(biāo)記顯示的供試親本間遺傳距離變異范圍為0.162～0.486，其中57-10-3-1H與13-2H-1之間的遺傳距離最遠，為0.486，表明這2個材料親緣關(guān)系較遠；而4-2H-4-1、40-2H-2和18-2-2H-2這三者兩兩之間的遺傳距離最近，均為0.162，表明這3個材料間親緣關(guān)系較近；參試親本間的平均遺傳距離為0.291，表明供試親本之間遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳差異不明顯，親緣關(guān)系較近，組配出強優(yōu)勢組合的概率較低。

2.4 F1農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢表現(xiàn)

通過計算F1主要農(nóng)藝性狀的中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢的變幅和平均值可獲知（表4），葉片數(shù)的中親優(yōu)勢最大，30個組合的中親優(yōu)勢的平均值為12.11%，變幅為－10.57%～39.27%，中親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)占50.00%；高親優(yōu)勢平均值為1.91%，變幅為－21.57%～26.27%，高親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)占33.33%。其次，中親優(yōu)勢較大的性狀是株高、外露長和根長，其30個組合的中親優(yōu)勢平均值分別是10.76%、8.17%和8.03%，變幅分別是－11.26%～49.24%、－7.48%～28.16%和－20.68%～40.56%，中親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占60.00%、60.00%和53.33%；高親優(yōu)勢平均值分別為3.50%、－2.55%和0.76%，變幅分別是－21.45%～30.21%、－15.89%～13.25%和－33.25%～31.24%，高親優(yōu)勢表現(xiàn)正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占43.33%、40.00%和43.33%，株高的高親優(yōu)勢最大。葉片長與葉片質(zhì)量的雜種優(yōu)勢都較小，其30個組合的中親優(yōu)勢平均值分別為3.68%與1.61%，變幅分別為－4.61%～17.38%和－2.03%～18.58%，中親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占63.33%和43.33%；高親優(yōu)勢平均值分別為－2.65%和－1.95%，變幅分別為－11.74%～5.34%和－9.88%～10.87%，高親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占36.67%和30.00%。綜合中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢結(jié)果來看，株高的雜種優(yōu)勢最大，其次是葉片數(shù)和根長，說明在蘿卜親本的篩選中應(yīng)優(yōu)先考慮的指標(biāo)是株高，其次是葉片數(shù)和根長指標(biāo)。

表2 親本主要農(nóng)藝性狀遺傳變異

表3 11個親本間的SRAP標(biāo)記遺傳距離（GD）

表4 F1主要產(chǎn)量相關(guān)性狀雜種優(yōu)勢

表5 SRAP標(biāo)記估算的遺傳距離和F1雜種優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)

2.5 SRAP標(biāo)記估算的遺傳距離與農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢的關(guān)系

將雙親分子遺傳距離、Fl雜種表現(xiàn)和農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢間的相關(guān)性進行分析（表5），分子遺傳距離與F1雜種表現(xiàn)的相關(guān)分析表明：分子遺傳距離與株高之間達顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.41，與其他5個農(nóng)藝性狀的相關(guān)系數(shù)都不顯著。分子遺傳距離與各農(nóng)藝性狀的中親優(yōu)勢相關(guān)分析表明：分子遺傳距離與株高、根長和葉片數(shù)間達顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.44、0.44、0.41，與外露長、葉片長和葉片質(zhì)量間相關(guān)系數(shù)均不顯著。與各農(nóng)藝性狀的高親優(yōu)勢相關(guān)分析表明：分子遺傳距離與株高間達極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.48，與根長和葉片數(shù)間均達顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.43和0.38，分子遺傳距離與外露長、葉片長和葉片質(zhì)量間相關(guān)系數(shù)均不顯著。

3 討論

3.1 蘿卜主要農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢

利用SRAP分子標(biāo)記進行蘿卜遺傳多樣性的分析已有報道，周娜[16]通過UPGMA聚類分析，將32份蘿卜分為4大類，和傳統(tǒng)的系譜分類一致。劉哲等[17]運用群體分離分析法從而篩選出SRAP引物組合，擴增出了和晚抽薹蘿卜基因緊密連鎖的多態(tài)性片段LB，從而成功做到了分子標(biāo)記輔助育種，并且通過這種方式降低了蘿卜選育過程中對表型性狀的依賴，大大提升了蘿卜育種的效率。本試驗結(jié)果和前人的研究結(jié)果都證明，運用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可有效地分析蘿卜材料的遺傳多樣性，實現(xiàn)快速劃分與利用雜種優(yōu)勢群。F1不同產(chǎn)量相關(guān)性狀的中親優(yōu)勢變幅為1.61%～12.11%，高親優(yōu)勢變幅為－2.65%～3.50%，說明了因為農(nóng)藝性狀與雜交組合的不同，蘿卜的農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢大小有很大的差別，其中，既存在表現(xiàn)雜種優(yōu)勢大的性狀與組合，也存在表現(xiàn)小的性狀與組合。

3.2 SRAP分子標(biāo)記預(yù)測雜種優(yōu)勢的可能性

遺傳距離是衡量品種間多個性狀綜合遺傳差異大小的指標(biāo)，植物育種實踐已經(jīng)檢驗并且承認了其客觀性，雙親的基因型差異越大，雜種優(yōu)勢越強[21]。由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者嘗試使用許多不同的分子標(biāo)記技術(shù)對不同作物的遺傳距離和雜種優(yōu)勢之間的相關(guān)性進行研究，并且獲得了不同的結(jié)論。Lee等[22]和Smith等[23]研究表明，分子標(biāo)記遺傳距離和雜種優(yōu)勢之間呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)；而廖伏明等[24]和張濤等[25]的研究卻表明分子標(biāo)記遺傳距離與F1雜種優(yōu)勢之間并沒有明顯的相關(guān)性，不能將其用于雜種優(yōu)勢的預(yù)測。

本研究結(jié)果表明，6個主要農(nóng)藝相關(guān)性狀雜種優(yōu)勢中株高的中親優(yōu)勢較大，高親優(yōu)勢最大，其次是葉片數(shù)、根長；在相同的SRAP標(biāo)記的遺傳距離和雜種優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)中，遺傳距離和株高的F1雜種的表現(xiàn)、中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)都呈顯著相關(guān)或極顯著相關(guān)水平，遺傳距離與葉片數(shù)、根長的中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)都呈顯著相關(guān)水平；說明在蘿卜親本的篩選中應(yīng)先考慮株高，其次是葉片數(shù)、根長，這樣才有可能在高密度直播種植模式下組配出雜種優(yōu)勢強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的組合而實現(xiàn)高產(chǎn)。另一方面，SRAP標(biāo)記的遺傳距離與F1雜種表現(xiàn)既有顯著相關(guān)，也有不顯著相關(guān)；與各主要農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢相關(guān)達到極顯著、顯著相關(guān)或不顯著相關(guān)水平，顯著或極顯著相關(guān)系數(shù)介于0.38～0.48，表明SRAP分子標(biāo)記遺傳距離在一定程度上能反映出農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢的強弱，但是其相關(guān)程度還不能夠準(zhǔn)確地預(yù)測雜種優(yōu)勢。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，SRAP遺傳距離和農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢與F1雜種表現(xiàn)的關(guān)系比較復(fù)雜。SRAP分子標(biāo)記遺傳距離雖然能反映材料間的遺傳差異，但是SRAP分子標(biāo)記是覆蓋在整個基因組上的，其雙親間的遺傳距離是親本全部位點上的差異，這涉及了大量和研究目標(biāo)性狀無關(guān)的位點，使用它來分析分子遺傳距離和雜種優(yōu)勢的相關(guān)性時將存在誤差；然而，通過運用與雜種優(yōu)勢相關(guān)的QTL連鎖的標(biāo)記位點來分析親本間的遺傳差異與雜種優(yōu)勢的相關(guān)性則更加具有準(zhǔn)確性。張濤等[6]通過運用和產(chǎn)量性狀相關(guān)的功能基因標(biāo)記分析了雜交水稻組合親本間的遺傳差異，從而研究了標(biāo)記遺傳距離和產(chǎn)量雜種優(yōu)勢的相關(guān)性，結(jié)果表明兩者呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，這可以證明功能基因標(biāo)記可以運用于雜交水稻雜種優(yōu)勢預(yù)測，但最終結(jié)果將依賴于雜種優(yōu)勢遺傳機理的闡明。