段江南　蘇宏　王發(fā)艷　楊希

摘 要：利用青海湖裸鯉養(yǎng)殖廢水對小球藻進行培養(yǎng)，以及在開放條件下對小球藻生長趨勢進行研究，同時篩選土著淡水輪蟲品種，為生物餌料的研究提供基礎(chǔ)支撐。本研究以BG11標準培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在實驗室和室內(nèi)開放條件下添加不同比例的養(yǎng)殖廢水，觀察小球藻的生長情況及水化學(xué)指標，將通過篩絹過濾得到的土著淡水輪蟲接種于小球藻內(nèi)培養(yǎng)，定期用顯微鏡觀察輪蟲個體生長情況和數(shù)量等參數(shù)。結(jié)果表明：小球藻能夠較好地利用培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮，添加魚塘水的培養(yǎng)基培養(yǎng)的小球藻前期長勢更好；室內(nèi)開放條件下，小球藻的生長周期及生物量都明顯縮短；分離篩選得到的龜甲輪蟲和臂尾輪蟲能夠正常掛卵，但長期生長狀態(tài)還需進一步實驗研究。

關(guān)鍵詞：青藏高原；小球藻；輪蟲；葉綠素a；氨態(tài)氮

1引言

小球藻（Chlorella）為綠藻門小球藻屬普生性單細胞綠藻，具有豐富的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、葉綠素和一些生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值豐富，可作為天然水產(chǎn)餌料，改善水體化學(xué)環(huán)境條件，起到調(diào)節(jié)水質(zhì)的作用，在水產(chǎn)飼料行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景，普遍見于淡水漁業(yè)生產(chǎn)[1]。尤其作為培養(yǎng)輪蟲的首選餌料，是淡水輪蟲大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素之一[2]。使用小球藻培養(yǎng)輪蟲，可優(yōu)化水質(zhì)并且提高培養(yǎng)總量，也可以作為一種優(yōu)質(zhì)餌料用于輪蟲的大規(guī)模培養(yǎng)[3]。與天然水產(chǎn)餌料相比，輪蟲的蛋白質(zhì)和粗脂肪含量均優(yōu)于其它，在適口性、易得性、飼養(yǎng)效果方面都屬上等餌料[4-7]。另外，輪蟲具有適應(yīng)性強、繁殖快、容易培養(yǎng)等特點，因而在水產(chǎn)行業(yè)多有應(yīng)用 [8-10]。

在青藏高原水生動物養(yǎng)殖及物種與環(huán)境保護方面小球藻并未得到廣泛應(yīng)用。高原特色物種青海湖裸鯉目前仍主要以雞蛋黃作為開口餌料，這種方法會導(dǎo)致成本偏高，在水體中投放量過多會造成水體污染，從而影響幼苗生長。為解決裸鯉開口餌料問題，本項目將小球藻作為輪蟲繁殖的主要營養(yǎng)物質(zhì)，同時以后期大規(guī)模培養(yǎng)為目的，利用魚塘養(yǎng)殖廢水與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同配比為實驗手段，探討適合小球藻大量快速生長的基本條件，為后期工廠化擴培小球藻提供實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料

實驗用小球藻購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，篩選土著淡水輪蟲品種的水樣取自青海湖裸鯉救護中心原種場西二魚塘底層，養(yǎng)殖廢水取自青海湖裸鯉救護中心原種場西二魚塘。

2.2方法

2.2.1不同配比培養(yǎng)基中小球藻生物量的測定方法

通過葉綠素a的含量間接反映小球藻的生物量，測定培養(yǎng)基葉綠素a的含量，用移液槍吸取4 mL小球藻液置于10 mL離心管中，于12000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入4 mL 80%丙酮重懸，4℃冰箱中放置過夜。將過夜重懸的藻液于12000 rpm離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至比色皿中，以80%丙酮作為對照，用紫外分光光度計測定OD663、OD645值，根據(jù)下式計算葉綠素a含量，Ca（mg/L）=12.7OD663-2.69OD645。

2.2.2培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的測定

向7支比色管中分別加入硫酸銨標準使用液0.00，0.10，0.20，0.40， 0.60，0.80，1.00 mL，加水稀釋至總體積10 mL，加A試劑、B試劑各1.25 mL（A試劑：5 g苯酚和25 mg二水合亞硝基鐵氰化鉀溶解、定容至100 mL；B試劑：2 mL次氯酸鈉溶液（NaClO）和2.5 g NaOH溶解、定容至100 mL）。于水浴鍋中50℃水浴20 min，冷卻，測定OD625，繪制標準曲線。水樣中氨態(tài)氮含量的測定：取水樣15 mL進行抽濾，得到過濾水樣，取10 mL過濾水樣放入比色管中，加入A試劑、B試劑各1.25 mL，于水浴鍋中50℃水浴20 min，冷卻，測定OD625，在標準曲線中查出氨態(tài)氮的含量。

2.2.3水樣初步處理及輪蟲篩選分離

將采集到的水樣攪拌均勻，使得水樣內(nèi)物體漂浮。取得的水樣用80目篩絹進行過濾，用少量暴曬兩天的自來水將過濾在篩絹上的物體反復(fù)仔細沖洗1-2次，收集沖洗得到的水樣，用200目篩絹將水樣再次反復(fù)在同一200目篩絹上過濾，小心收集篩絹上所過濾得到的物體，用200 mL經(jīng)暴曬的自來水充分沖洗至250 mL燒杯中。用膠頭滴管吸取1-2 mL燒杯中的水樣滴加到浮游生物計數(shù)框內(nèi)置于光學(xué)顯微鏡下，先用4倍物鏡找到清晰視野觀察尋找輪蟲；找到后將物鏡擴大至10倍調(diào)焦至清晰，接著再將物鏡轉(zhuǎn)換為40倍調(diào)焦至清晰并用拍照留圖，之后利用吸嘴前端剪去2-3 mm的2.5 μL移液槍槍頭在顯微鏡下分離輪蟲。

3結(jié)果與分析

3.1不同配比魚塘水小球藻生物量及氨態(tài)氮含量分析

實驗結(jié)果表明，BG11/魚塘水為1：1和1：2的培養(yǎng)基，在1-9天內(nèi)生物量明顯高于BG11培養(yǎng)基（P<0.05），在第9天達到峰值，葉綠素a含量分別為0.617 mg/L和0.710 mg/L，從第9天起進入衰亡期；BG11培養(yǎng)基葉綠素a含量在第24天達最大值1.097 mg/L，與初始葉綠素a含量相比增加0.991 mg/L，日平均生長量為0.041 mg/L，從第24天起進入衰亡期。以葉綠素a為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制小球藻在不同培養(yǎng)基條件下的生長曲線，生長曲線見圖1。

小球藻對氨態(tài)氮的利用效果較好，三種培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的初始濃度：1：2>1：1>BG11，且1：2培養(yǎng)基在第6天左右氨態(tài)氮含量達到最低值0.013 mg/L，1：1培養(yǎng)基在第9天左右氨態(tài)氮含量達到最低值0.034 mg/L，BG11培養(yǎng)基在第9天左右氨態(tài)氮含量達到最低值0.044 mg/L。從第10天起，可能存在硝態(tài)氮與氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮含量均有所回升。培養(yǎng)基中氨態(tài)氮含量變化情況如圖2。

3.2室內(nèi)開放培養(yǎng)與實驗室條件下小球藻生長情況的分析

室內(nèi)開放培養(yǎng)中葉綠素a的初始含量為0.104mg/L，隨時間的變化為0～15 d上升，15 d后急速下降；實驗室條件下小球藻的葉綠素a初始含量為0.106 mg/L，隨時間變化經(jīng)歷對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期，培養(yǎng)周期明顯長于室內(nèi)開放培養(yǎng)。

3.3顯微鏡下輪蟲的篩選分離

通過鏡檢可發(fā)現(xiàn)，青海湖裸鯉救護中心原種場西二魚塘水中生長有兩種不同的輪蟲，分別為臂尾輪蟲和龜甲輪蟲，鏡檢圖見圖3、圖4。分離過程中發(fā)現(xiàn)，臂尾輪蟲數(shù)量為1只/mL較龜甲輪蟲3只/mL少，但個體較大且活性及游動能力很強，未見有其卵存在；龜甲輪蟲屬于優(yōu)勢種群，但個體較小且活性及游動能力很弱，有掛卵成蟲和卵團存在。

4討論

BG11/魚塘水為1：1與1：2小球藻的延滯期短，有可能是添加了魚塘水后有機質(zhì)豐富，小球藻快速渡過了這一時期，但BG11/魚塘水為1：1與1：2小球藻的最大生物量和對數(shù)生長期不如BG11，可能是由于微量元素的差異。實驗表明小球藻對氨態(tài)氮的利用效果較好，BG11培養(yǎng)基在第9天左右氨態(tài)氮含量達到最低值0.044 mg/L。從第10天起，可能存在硝態(tài)氮與氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮含量有所回升，由此可以看出，小球藻對氨態(tài)氮的吸收不是簡單的正比關(guān)系。

葉綠素a含量變化結(jié)合溫度變化可知，在室內(nèi)開放條件下培養(yǎng)的小球藻與實驗室條件下培養(yǎng)的小球藻相比，前者的生長時期縮短20天左右，沒有延緩期，衰亡迅速，葉綠素a含量差異顯著，可能因為所在環(huán)境溫度不穩(wěn)定，并且由于敞開培養(yǎng)導(dǎo)致外界生物進入培養(yǎng)體系，對其生長產(chǎn)生影響。

由于輪蟲具有生命活性，在浮游生物計數(shù)框內(nèi)會保持游動狀態(tài)，因此顯微鏡下分離輪蟲時一定要保證目標輪蟲始終在視野范圍內(nèi)，用處理過的2.5 μL微量移液槍迅速吸出輪蟲后完成轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時應(yīng)反復(fù)吹打移液槍，防止輪蟲粘在槍頭；用于培養(yǎng)輪蟲的小球藻濃度不易過高，保持在105個/mL即可，濃度過高會影響輪蟲生長，其原因一方面是小球藻過度生長繁殖造成培養(yǎng)瓶內(nèi)養(yǎng)分與氧氣缺乏，影響輪蟲正常生長活動，另一方面是小球藻濃度過高會使取樣鏡檢輪蟲的難度增加，不利于觀察；通過鏡檢發(fā)現(xiàn)小球藻有可能被其他藻類污染出現(xiàn)大面積死亡，從而導(dǎo)致輪蟲生存環(huán)境受脅，說明實驗過程中培養(yǎng)液易被污染，以后再做此類實驗時盡可能保持無菌環(huán)境，生長培育實驗還需要進一步進行。

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作者簡介：

段江南（1993—），男，學(xué)士，就讀院校：青海大學(xué)。

楊希（1983-），通訊作者，博士，講師，主要研究方向：水生生物學(xué)。

基金項目：青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（2016-S-3）