孔海龍，韋 旭，周 倩，黃 銳，馬同軍

(皖南醫(yī)學(xué)院 1．臨床醫(yī)學(xué)院;2．人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)以漸進(jìn)性學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能障礙、人格改變和語(yǔ)言障礙等為主要臨床表現(xiàn)。AD致死率僅次于癌癥、心血管疾病和腦血管疾病，已發(fā)展成為引起老年患者死亡的“第四大殺手”[1]。目前對(duì)于AD西醫(yī)治療尚無(wú)特效方法，而我國(guó)中醫(yī)的針刺方法在治療該疾病過(guò)程中顯示出較好的療效[2]。天麻素為蘭科多年生草本植物天麻干燥塊莖的有效成分，具有健腦增智、鎮(zhèn)靜安神和治療失眠的作用，對(duì)治療AD療效明顯[3]。關(guān)于電針結(jié)合天麻素對(duì)AD大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合Aβ1-40海馬注射的方法制備AD模型，通過(guò)觀察電針結(jié)合天麻素對(duì)AD大鼠海馬CA1區(qū)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(acetylcholine transferase，ChAT)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)表達(dá)的變化，為探討電針結(jié)合天麻素治療AD大鼠的作用機(jī)制提供一定的形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 60只SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)買于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK(浙)-2014-0001。將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組、生理鹽水組、模型組、電針組、天麻素組、針?biāo)幗Y(jié)合組，每組10只。

1.2 主要試劑和儀器 Aβ1-40、D-半乳糖(Sigma公司)，天麻素注射液(規(guī)格5 mL∶500 mg，西南藥業(yè)股份有限公司)，SABC染色試劑盒、兔抗AChE、兔抗ChAT、DAB顯色劑(武漢博士德公司)，華佗牌SDZ-II型電子針療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)，華佗牌無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，江灣Ⅰ型鼠腦立體定向儀。

1.3 動(dòng)物模型的建立 參照文獻(xiàn)[4]建立動(dòng)物模型。將Aβ1-40用前在37℃恒溫箱中孵育1周，使其凝聚老化，備用。模型組、電針組、天麻素組、針?biāo)幗Y(jié)合組4組大鼠按120 mg/(kg·d)腹腔注射D-半乳糖，連續(xù)8周；生理鹽水組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)8周；正常對(duì)照組大鼠不做任何處理。模型組、電針組、天麻素組、針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠在D-半乳糖連續(xù)處理8周后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，參照文獻(xiàn)[5]和大鼠腦立體定位圖譜以前囟后3.5 mm，正中線旁開(kāi)2.0 mm，深度2.8 mm，雙側(cè)海馬注射Aβ1-40。生理鹽水組腹腔注射等量生理鹽水且于雙側(cè)海馬注射等量生理鹽水2 μL。正常對(duì)照組大鼠不做任何處理。

1.4 治療方法 電針組與針?biāo)幗Y(jié)合組按《大鼠穴位圖譜的研制》標(biāo)準(zhǔn)選取“百會(huì)”、“大椎”、“足三里”穴，頻率2 Hz，強(qiáng)度3V，每次30 min，每日1次，電針4周。天麻素組與電針結(jié)合天麻素組將天麻素注射液(5 mL∶500 mg)按10 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)4周。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 治療結(jié)束后以10%水合氯醛麻醉，經(jīng)左心室快速滴注生理鹽水，取腦，置于4%多聚甲醛液中固定24 h，依次脫水透明后制成蠟塊。取海馬連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。按SABC法試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，封片。每組取海馬切片各20張(每只隨機(jī)選取2張)，統(tǒng)計(jì)400倍視野下海馬CA1區(qū)ChAT與AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值變量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)ChAT的表達(dá) ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元呈空泡狀，棕色或棕黃色，著色部位主要位于胞質(zhì)和胞膜。與正常對(duì)照組、生理鹽水組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.05)；與模型組比較，電針組和天麻素組大鼠海馬CA1區(qū)的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量增多(P<0.05)；與電針組和天麻素組比較，針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠海馬CA1區(qū)的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量增多(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1。

A.正常對(duì)照組；B.生理鹽水組；C.模型組；D.電針組；E.天麻素組；F.針?biāo)幗Y(jié)合組。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT表達(dá)

2.2 海馬CA1區(qū)AChE的表達(dá) AChE陽(yáng)性神經(jīng)元呈空泡狀，棕色或棕黃色，著色部位主要位于胞漿和胞膜。與正常對(duì)照組、生理鹽水組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)的AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量增多(P<0.05)；與模型組比較，電針組和天麻素組大鼠海馬CA1區(qū)的AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.05)；與電針組和天麻素組比較，針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠海馬CA1區(qū)的AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

A.正常對(duì)照組；B.生理鹽水組；C.模型組；D.電針組；E.天麻素組；F.針?biāo)幗Y(jié)合組。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)AChE表達(dá)

組別ChATAChE正常對(duì)照組67.20±9.1950.50±8.71生理鹽水組66.10±6.3551.20±5.85模型組40.90±3.87?73.90±7.72?電針組50.50±4.60?△▲66.00±6.68?△▲天麻素組49.00±6.36?△▲66.30±9.07?△▲針?biāo)幗Y(jié)合組56.40±5.97?△58.70±4.50?△F26.79716.327P0.0000.000

注：與正常對(duì)照組或生理鹽水組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針?biāo)幗Y(jié)合組比較，▲P<0.05。

3 討論

腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶方面起著重要作用，乙酰膽堿(Ach)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的一種遞質(zhì)，隨著人體機(jī)體的老化，腦組織中Ach含量明顯減少，Ach含量的降低將加速腦細(xì)胞的衰亡，使記憶力下降，進(jìn)而可誘發(fā)AD[6]。腦內(nèi)Ach的含量取決于Ach生成與水解的平衡，而AChE和ChAT是中樞膽堿能系統(tǒng)特異性酶，與腦內(nèi)Ach的含量密切相關(guān)。AChE是Ach的水解酶，ChAT是Ach合成的限速酶。AChE在膽堿能神經(jīng)元的突觸、胞體中含量較多，膽堿能神經(jīng)元的活性可由AChE的含量來(lái)體現(xiàn)，是反映腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要標(biāo)志酶[7]。ChAT產(chǎn)生于膽堿能神經(jīng)元的胞體內(nèi)，與Ach在腦內(nèi)的分布平行，是反映Ach含量的重要指標(biāo)[8]。AD發(fā)生時(shí)，海馬內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元大量變性丟失，使得腦內(nèi)ChAT活性降低，造成Ach的合成、釋放和儲(chǔ)存減少，進(jìn)而導(dǎo)致以記憶和認(rèn)知障礙為主的多種臨床表現(xiàn)的發(fā)生[9]。

中醫(yī)認(rèn)為AD發(fā)病部位在腦，以髓海空虛、神機(jī)失用為根本病因[10]。百會(huì)屬督脈，有升陽(yáng)舉陷、開(kāi)竅醒腦之功效[11]。大椎穴為督脈之腧穴，統(tǒng)領(lǐng)諸陽(yáng)經(jīng)，為調(diào)整全身機(jī)能的要穴。足三里為胃經(jīng)合穴，有升精降濁，導(dǎo)痰行滯之功效[12]。有研究[13]表明電針可明顯改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶功能，有效率可達(dá)到83.33%。電針可通過(guò)修復(fù)受損神經(jīng)元突觸，重新構(gòu)建神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)連接，從而達(dá)到防治AD的作用[14]。天麻素又名天麻甙，對(duì)失眠、焦慮和神經(jīng)衰弱等癥狀有緩解作用，能夠減輕AD模型腦內(nèi)炎癥并可提高學(xué)習(xí)記憶能力[15]。AChE和ChAT是Ach分解與合成的兩個(gè)重要的特異性酶，而天麻素可通過(guò)調(diào)節(jié)AChE或ChAT的活性發(fā)揮膽堿能效應(yīng)，增強(qiáng)神經(jīng)突觸興奮性，從而提高學(xué)習(xí)記憶的能力[16]。

本實(shí)驗(yàn)選取“百會(huì)”、“大椎”、“足三里”穴，對(duì)AD大鼠進(jìn)行電針結(jié)合天麻素治療，并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察AD大鼠大腦海馬CA1區(qū)AChE和ChAT的變化。結(jié)果顯示模型組大鼠海馬CA1區(qū)AChE的表達(dá)高于正常對(duì)照組和生理鹽水組，ChAT的表達(dá)低于正常對(duì)照組和生理鹽水組，提示模型組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)膽堿能神經(jīng)元可能受到損傷和破壞。治療后電針組與天麻素組大鼠海馬CA1區(qū)AChE的表達(dá)降低，ChAT的表達(dá)增高，以針?biāo)幗Y(jié)合組的表達(dá)最為顯著，提示電針結(jié)合天麻素具有顯著的增效作用，這可能通過(guò)抑制AChE和上調(diào)ChAT的表達(dá)，修復(fù)受損膽堿能神經(jīng)元，調(diào)節(jié)Ach的生理代謝，從而達(dá)到治療AD的作用。