金中行，徐宏光，張 玙，劉 晨，肖 良，王 效，沈 陽(yáng)

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 脊柱外科，安徽 蕪湖 241001)

椎間盤(pán)退變是一種常見(jiàn)疾病，研究人員將關(guān)注點(diǎn)集中在髓核退變上，發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)在吸收震蕩和保持髓核組織形態(tài)上發(fā)揮了重要作用[1]。如何防止纖維環(huán)的退變是研究人員關(guān)心的問(wèn)題。有報(bào)道表明，術(shù)中顯微內(nèi)窺鏡下行纖維環(huán)修復(fù)可得到較好的療效[2]，對(duì)癥治療雖可即刻緩解患者的臨床癥狀，但不可避免地會(huì)改變脊柱的正常生理結(jié)構(gòu)，日后很可能會(huì)出現(xiàn)鄰近節(jié)段退變、繼發(fā)性脊柱不穩(wěn)等一系列問(wèn)題，利用組織工程技術(shù)重建纖維環(huán)結(jié)構(gòu)可能成為比較理想的治療方式。

體外獲取充足的活性較強(qiáng)的纖維環(huán)種子細(xì)胞對(duì)此項(xiàng)技術(shù)具有重要意義。已有研究表明，可以從人纖維環(huán)組織分離出纖維環(huán)干細(xì)胞[3]，但存在取材困難，退變纖維環(huán)提取出的干細(xì)胞活力較差等問(wèn)題。本研究應(yīng)用單細(xì)胞克隆法從大鼠尾椎椎間盤(pán)組織分離純化纖維環(huán)源干細(xì)胞，具有取材方便，干細(xì)胞純度高以及細(xì)胞數(shù)量豐富等優(yōu)勢(shì)，為后續(xù)研究纖維環(huán)干細(xì)胞特征建立了體外模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%二型膠原酶(Sigma),磷酸鹽緩沖液(PBS)(SH30256.01,hyclone),青霉素-鏈霉素溶液(15070063，Gibco)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco),干細(xì)胞胎牛血清(Gibco)，干細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A1007201，Gibco)，干細(xì)胞成脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A1007001，Gibco)，干細(xì)胞成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A1007101，Gibco)，茜素紅染色液(南京森貝伽生物科技有限公司)，油紅O染色劑(O 0625，Sigma),番紅染色液(南京森貝伽生物科技有限公司)，0.1%結(jié)晶紫染色劑(C8407，索萊寶)，4%多聚甲醛固定液，10 cm培養(yǎng)皿和T24培養(yǎng)瓶(Corning)。

1.2 標(biāo)本選取 選取4周齡SD大鼠10只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后頸椎脫臼法處死，在含有75%酒精的燒瓶中浸泡消毒4 min，在無(wú)菌工作臺(tái)上撕脫大鼠尾椎皮膚，用剪刀離斷尾椎，分離其中的椎間盤(pán)，用尖刀片去掉其中的髓核組織，將所得纖維環(huán)組織浸泡在含有1%青霉素-鏈霉素的PBS液的培養(yǎng)皿中。

1.3 纖維環(huán)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng) 將新鮮纖維環(huán)組織用含有1%青霉素-鏈霉素的PBS液，沖洗至透明，眼科剪將組織修剪為1 mm3大小的組織塊，PBS液沖洗干凈，以100 U/mL的膠原酶和16 U/mL的透明質(zhì)酸酶在磁力攪拌條件下消化3～5 h，至組織塊逐漸消失。消化物用篩網(wǎng)過(guò)濾。過(guò)濾后的液體以800 r/min低速離心5 min，棄上清液；用DMEM培養(yǎng)液沖洗，800 r/min低速離心5 min，重復(fù)3 次。以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液吹打混勻，細(xì)胞懸液以50、100、200個(gè)/ cm2接種于10 cm培養(yǎng)皿。每2天換1 次液，待細(xì)胞80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行傳代用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)，按培養(yǎng)面積1∶3 的比例接種于24 孔板中。

1.4 纖維環(huán)干細(xì)胞鑒定

1.4.1 單克隆細(xì)胞集落形成分析 以50、100、200個(gè)/cm2不同密度接種的原代細(xì)胞培養(yǎng)8～10 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成單位，不同密度接種的培養(yǎng)皿各取3份，分成3組，吸去培養(yǎng)基，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS液清洗3次后滴加0.1%結(jié)晶紫染劑，染色15 min后PBS溶液輕緩沖洗3次，隨后肉眼觀察集落形態(tài)和數(shù)目。

1.4.2 成骨誘導(dǎo)分化和染色 選擇接種在24孔板中的第2代大鼠纖維環(huán)源干細(xì)胞，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%時(shí)，吸去基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入成骨誘導(dǎo)液，每隔3 d換液，持續(xù)培養(yǎng)21 d，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組。移去誘導(dǎo)液，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS液清洗3次，移去液體加入茜素紅染劑，室溫放置1 h,棄去染色劑，PBS液清洗3次后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4.3 成軟骨誘導(dǎo)分化和染色 選擇接種在24孔板中的第2代大鼠纖維環(huán)源干細(xì)胞，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入成軟骨誘導(dǎo)液，每隔3 d換液，持續(xù)培養(yǎng)21 d，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組。移去誘導(dǎo)液，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS液清洗3次，棄上清加入番紅染色劑,室溫放置1 h,棄去染色劑，PBS液清洗3次后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4.4 成脂肪誘導(dǎo)分化和染色 選擇接種在24孔板中的第2代大鼠纖維環(huán)源干細(xì)胞，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入成脂肪誘導(dǎo)液，每隔3 d換液，持續(xù)培養(yǎng)12 d，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組。移去誘導(dǎo)液，PBS液清洗3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS液清洗3次，移去液體加入油紅O染色劑,室溫放置1 h，棄去染色劑，PBS液清洗3次后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 纖維環(huán)干細(xì)胞集落形成能力觀察 倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞集落生成單位，判斷干細(xì)胞集落生成能力。大鼠纖維環(huán)源細(xì)胞以低密度接種于培養(yǎng)皿中，8～10 d后可在倒置顯微鏡下明顯觀察到單克隆來(lái)源的細(xì)胞集落形成(圖1)。

圖1 大鼠纖維環(huán)干細(xì)胞單克隆細(xì)胞集落

2.2 結(jié)晶紫染色觀察 原代細(xì)胞接種密度的差異會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞集落生成能力的不同。0.1%結(jié)晶紫液染色15 min,PBS液緩慢清洗多次，肉眼觀察可見(jiàn)，3組培養(yǎng)皿中均可見(jiàn)遍布皿底的藍(lán)紫色類(lèi)圓型細(xì)胞集落，200個(gè)/cm2密度接種的細(xì)胞集落密度最大，細(xì)胞集落形成數(shù)目與接種密度呈正相關(guān)(圖2)。

A.50個(gè)/cm2密度接種；B.100個(gè)/cm2密度接種；C.200個(gè)/cm2密度接種。

圖2 結(jié)晶紫染色觀察

2.3 纖維環(huán)干細(xì)胞的三系誘導(dǎo)分化結(jié)果 通過(guò)對(duì)纖維環(huán)源干細(xì)胞成脂，成骨和成軟骨誘導(dǎo)分化后染色，鑒定其多向分化潛能(圖3)。成骨誘導(dǎo)染色倒置顯微鏡下可見(jiàn)視野內(nèi)大量紅染的鈣結(jié)節(jié)形成。對(duì)照組未見(jiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)形成(圖3A)。成脂誘導(dǎo)染色倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)外有大量紅染脂滴形成。對(duì)照組未見(jiàn)明顯脂滴形成(圖3B)。成軟骨誘導(dǎo)染色倒置顯微鏡下可見(jiàn)視野內(nèi)類(lèi)圓形軟骨樣細(xì)胞形成，周?chē)奂t染的軟骨細(xì)胞特異性分泌的聚集蛋白聚糖。對(duì)照組未見(jiàn)明顯紅染區(qū)域(圖3C)。

A.成骨誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞周?chē)t染鈣結(jié)節(jié)形成，對(duì)照組未見(jiàn)染色區(qū)域。B.成脂誘導(dǎo)12 d后，細(xì)胞內(nèi)外聚集有紅染脂滴形成，對(duì)照未見(jiàn)明顯染色。C.成軟骨誘導(dǎo)21 d后，廣泛可見(jiàn)紅染聚集蛋白聚糖形成，對(duì)照組未見(jiàn)紅染區(qū)域。

圖3 大鼠纖維環(huán)干細(xì)胞的三系誘導(dǎo)分化染色

3 討論

制備體外纖維環(huán)組織有兩大必備因素：種子細(xì)胞和仿生支架。理想的種子細(xì)胞常被認(rèn)為是自體纖維環(huán)細(xì)胞，但是體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，纖維環(huán)細(xì)胞隨著傳代的進(jìn)行，細(xì)胞活力會(huì)逐漸喪失[4]，分泌胞外基質(zhì)的能力也逐漸下降，同時(shí)，獲取人纖維環(huán)細(xì)胞比較困難且細(xì)胞數(shù)量有限。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，骨髓和脂肪等組織均含有較豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，常被作為組織工程種子細(xì)胞[5]。給予適宜生長(zhǎng)的微環(huán)境，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為類(lèi)髓核樣細(xì)胞[6]，也可在體外纖維環(huán)支架上分化為成纖維樣細(xì)胞[7]，但同時(shí)有研究表明，不同來(lái)源組織的間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化潛能并不一致，滑膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞趨向于分化軟骨細(xì)胞，脂肪來(lái)源干細(xì)胞的成脂能力更強(qiáng)[8]。因此我們認(rèn)為纖維環(huán)來(lái)源干細(xì)胞更適合成為纖維環(huán)組織工程的種子細(xì)胞。相較于大鼠腰椎，取材大鼠尾椎避免腰椎后入路必要的肌肉剝離，簡(jiǎn)化了操作時(shí)間，實(shí)驗(yàn)證明尾椎所提取的原代細(xì)胞，活力豐富，增殖能力較強(qiáng)[9]。

纖維環(huán)干細(xì)胞的獲取來(lái)之不易，純化和分離纖維環(huán)干細(xì)胞已然非常必要，流式細(xì)胞分選法和免疫磁珠分選技術(shù)作為間充質(zhì)干細(xì)胞篩選法[10]，已被人們熟知，具有可分選細(xì)胞數(shù)量巨大，分選細(xì)胞純度高等優(yōu)點(diǎn)，但操作過(guò)程中也不可避免地會(huì)對(duì)細(xì)胞活力造成影響。采用微孔板單克隆培養(yǎng)法，是基于干細(xì)胞具有體外單克隆集落形成能力，有研究表明，脂肪來(lái)源基質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)單克隆培養(yǎng)法獲得純系干細(xì)胞集落[11]，本研究運(yùn)用微孔板單克隆細(xì)胞培養(yǎng)法，倒置顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)集落內(nèi)細(xì)胞形態(tài)均一，低密度細(xì)胞接種過(guò)程中，干細(xì)胞群體逐漸表現(xiàn)出增殖優(yōu)勢(shì)，篩選出純度較高的干細(xì)胞集落，且增殖能力較強(qiáng)，故此方法對(duì)細(xì)胞活力并無(wú)較大影響，證實(shí)了微孔板單克隆培養(yǎng)法的可行性，為后續(xù)研究提供了可靠的體外細(xì)胞模型和可靠的分離純化纖維環(huán)干細(xì)胞的方法。