王欣怡 ，李雪源 ，龔照龍 ，王俊鐸 ，范李萍 ，鄭巨云 ，梁亞軍 ，郭江平 ，買(mǎi)買(mǎi)提·莫明 ，艾先濤 *

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊830091）

新疆是我國(guó)棉花的主產(chǎn)區(qū)，以超過(guò)50%的面積貢獻(xiàn)了近3/4的產(chǎn)量，為保障我國(guó)棉花生產(chǎn)安全發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)，隨著種業(yè)發(fā)展速度的加快，市場(chǎng)化程度的提高，棉花品種同質(zhì)化、種子質(zhì)量下降、品種套牌等問(wèn)題突出，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。此外，骨干親本的反復(fù)利用及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在棉花育種中的應(yīng)用導(dǎo)致品種間遺傳差異越來(lái)越小，僅依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)手段難以滿(mǎn)足品種鑒定需求[1]。因此，加強(qiáng)檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新，為種子質(zhì)量鑒定提供高效技術(shù)手段極為必要。

分子標(biāo)記繪制的品種指紋圖譜像人的指紋一樣具有特異性，能夠快速準(zhǔn)確鑒定品種或品系，為作物育種和種子管理提供了極大的便利[2]。相較于其他分子標(biāo)記，以微衛(wèi)星序列（Simple sequence repeats,SSR）為基礎(chǔ)的標(biāo)記具有擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于作物指紋圖譜構(gòu)建中[3-4]。1996年郭旺珍等[5]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA （Random amplified polymorphic DNA,RAPD）標(biāo)記對(duì)我國(guó)9個(gè)棉花主栽品種構(gòu)建了指紋圖譜。李育強(qiáng)等[6]利用SSR分子標(biāo)記方法構(gòu)建了長(zhǎng)江流域湘雜棉系列品種的指紋圖譜。匡猛等[7]以32個(gè)棉花品種為材料，利用SSR標(biāo)記為其構(gòu)建了DNA指紋圖譜，并指出核心引物組合法更適合棉花指紋圖譜構(gòu)建的工作。聶新輝等[8]利用40對(duì)SSR引物構(gòu)建了51份新陸早系列品種的指紋圖譜。張玉翠等[9]利用40對(duì)SSR引物為32份棉花主栽品種構(gòu)建了DNA指紋圖譜。符家平等[10]選用8對(duì)SSR核心標(biāo)記為棉花雜交種C111建立了DNA指紋，給雜交棉的純度檢測(cè)提供了分子水平上的參考。付小瓊等[11]以中棉所63為研究對(duì)象，選用SSR引物建立了該品種的DNA指紋，旨在保護(hù)中棉所63的品種權(quán)。

已有的關(guān)于新疆陸地棉品種指紋圖譜的研究大多針對(duì)早熟棉品種，研究結(jié)果缺少代表性。本研究收集了從1979年至2013年近40年間新疆審定的120個(gè)陸地棉品種，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建其指紋圖譜，為今后棉花品種DNA指紋鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從1979年至2013年近40年間新疆審定的120個(gè)陸地棉品種（品種名稱(chēng)、系譜來(lái)源及選育單位見(jiàn)本文在《棉花學(xué)報(bào)》網(wǎng)站的電子資源附表1）包括軍棉1號(hào)、新陸早系列品種62份和新陸中系列品種57份，來(lái)源于新疆巴州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所種質(zhì)資源庫(kù)及各育種單位。

1.2 棉花基因組DNA的提取

待植株苗期摘取幼嫩葉片，利用改良CTAB法[12]結(jié)合自動(dòng)磨樣機(jī)快速提取棉花基因組DNA。利用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA的純度與濃度。

1.3 SSR引物來(lái)源

引物信息來(lái)源于CMD數(shù)據(jù)庫(kù)、CottonDB數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)資料[8,13-14]公布的引物，選擇有染色體定位信息的SSR標(biāo)記共計(jì)586對(duì)，引物包括DPL、CGR、NAU、BNL 和 JESPR 等類(lèi)型，由華大科技（廣東深圳）有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳分析

PCR（Polymerase chain reaction）反應(yīng)體系包括 DNA 模板（60 ng·μL–1）1 μL，正、反向引物（4 pmol·μL–1） 各 0.5 μL，10×緩沖液 1 μL，dNTPs（各 2.5 mmol·L–1）0.2 μL，Taq 酶 （5 U·μL–1）0.1 μL 和 ddH2O 6.7 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性 45 s，55℃退火 35 s，72℃延伸 45 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸12 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，電泳結(jié)束后用快速銀染法[15]染色觀(guān)察結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR產(chǎn)物在凝膠上的相對(duì)位置，每對(duì)引物生成的不同基因型直接編號(hào)，構(gòu)建120個(gè)陸地棉品種的DNA分子指紋圖譜。其中電泳結(jié)果采用二進(jìn)制0，1系統(tǒng)記錄譜帶位置，某一擴(kuò)增條帶有帶記為1，無(wú)帶記為0。將每對(duì)引物在品種間擴(kuò)增得到二進(jìn)制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，由引物組合的十進(jìn)制數(shù)字串作為每個(gè)品種的數(shù)字指紋。在進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化時(shí)，以位數(shù)最多的十進(jìn)制數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，位數(shù)不足的加 “0”補(bǔ)足位數(shù)。利用NTSYS-pc 2.10進(jìn)行遺傳多樣性分析。根據(jù)SimQual程序求Jaccard相似系數(shù)；采用類(lèi)平均法（Unweighted pair group method arithmetic averages,UPGMA），對(duì)遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類(lèi)，并繪制樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

查閱系譜資料，選擇8份親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料對(duì)586對(duì)候選引物進(jìn)行初步篩選，得到190對(duì)初篩引物，占引物總數(shù)目32.4%。隨后對(duì)120個(gè)材料復(fù)篩，最終確定78對(duì)多態(tài)性高、帶型清晰的SSR引物定為本次試驗(yàn)的核心引物（引物具體信息見(jiàn)本文在《棉花學(xué)報(bào)》網(wǎng)站的電子資源附表2）。引物選擇按照染色體分布原則，綜合考慮多態(tài)性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，每條染色體選擇3對(duì)引物。不同染色體上的標(biāo)記檢測(cè)到的等位位點(diǎn)個(gè)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)個(gè)數(shù)都有很多差異。78對(duì)核心引物在120個(gè)材料中共檢測(cè)392個(gè)等位變異，平均等位變異數(shù)5.03，變幅為2～10；其中多態(tài)性位點(diǎn)324個(gè)，多態(tài)性比例達(dá)82.7%。

2.2 SSR指紋圖譜構(gòu)建

利用上述78對(duì)核心引物對(duì)120個(gè)新疆陸地棉品種進(jìn)行SSR指紋分析。結(jié)果顯示，具有特征譜帶的品種共計(jì)17個(gè)（表1），僅用1對(duì)特征引物即可與其它品種區(qū)分開(kāi)。其中，新陸中43號(hào)有4對(duì)特征引物；新陸早41號(hào)與新陸中31號(hào)有2對(duì)特征引物；另外14個(gè)品種各有1對(duì)特征引物。引物NAU5128在新陸早4號(hào)、新陸早24號(hào)、新陸中15號(hào)、新陸中31號(hào)中均表現(xiàn)出特征譜帶；引物NAU2083在新陸中6號(hào)、新陸中31號(hào)、新陸中43號(hào)、新陸中59號(hào)中表現(xiàn)出特征譜帶，且將其余116個(gè)品種區(qū)分為12個(gè)類(lèi)型，表明引物NAU2083多態(tài)性較豐富，在進(jìn)行品種鑒定時(shí)可優(yōu)先采用。就本研究而言，僅僅依靠特征引物難以完成120個(gè)品種的鑒別，因此還需要采用引物組合法進(jìn)一步提高引物的鑒別能力。

表1 具有特征引物的17個(gè)棉花品種Table 1 Primers with specific amplifications for cotton cultivars

構(gòu)建指紋圖譜的原則是選用最少的引物數(shù)目以區(qū)分盡可能多的品種。本研究從78對(duì)核心引物中優(yōu)先選擇多態(tài)性豐富的引物，對(duì)120個(gè)棉花品種進(jìn)行指紋分析。結(jié)果顯示，當(dāng)選擇NAU2083、CGR5651、BNL1694、CGR5707 以 及CGR5576這5對(duì)引物進(jìn)行組合時(shí)，可以鑒別76個(gè)品種。增加MUSS95和HAU1413這2對(duì)多態(tài)性相對(duì)豐富的引物，可鑒別105個(gè)品種。剩余的15 個(gè) 品 種 可 以 利 用 TMB2295、BNL3937、NAU1102、GH277以及 NAU3732這5對(duì)引物將其區(qū)分開(kāi)。這12對(duì)引物（表2）按照以上順序組合鑒定，可將120個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)。圖1為引物NAU2083對(duì)部分棉花品種的擴(kuò)增結(jié)果。

本研究中，完成指紋圖譜構(gòu)建所需引物數(shù)目共計(jì)12對(duì)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，這些引物擴(kuò)增得到3～9種等位變異，共74個(gè)等位位點(diǎn)。采用“0、1”法記錄譜帶，將二進(jìn)制01數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制數(shù)據(jù)，用轉(zhuǎn)化后的十進(jìn)制數(shù)據(jù)構(gòu)建了120個(gè)陸地棉品種的指紋圖譜。以新陸早1號(hào)為例，引物NAU2083的擴(kuò)增結(jié)果為100110111，將該二進(jìn)制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制數(shù)據(jù)為311，由9位數(shù)變?yōu)榱?位數(shù)；CGR5707的擴(kuò)增結(jié)果為11111111，轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制數(shù)據(jù)為255，由8位數(shù)變?yōu)榱?位數(shù)。12對(duì)引物組合得到的十進(jìn)制數(shù)字串即代表每個(gè)品種的數(shù)字指紋（120個(gè)品種的SSR指紋圖譜見(jiàn)本文在《棉花學(xué)報(bào)》網(wǎng)站的電子資源附表3）。

表2 12對(duì)SSR引物信息Table 2 List of 12 primer

圖1 引物NAU2083對(duì)部分棉花品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 DNA fragments amplified by SSR primer NAU2083 in partial cotton cultivar

2.3 遺傳多樣性分析

利用NTSYS-pc 2.10軟件依據(jù)SSR標(biāo)記所統(tǒng)計(jì)的基因型數(shù)據(jù)，采用Jaccard系數(shù)計(jì)算出120個(gè)供試品種的成對(duì)遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明，120個(gè)供試品種之間的遺傳相似系數(shù)變化0.50～0.96，平均為0.73；遺傳相似系數(shù)偏高，表明新疆陸地棉品種之間的遺傳水平較狹窄。其中，相似性系數(shù)最高的2個(gè)品種是新陸早27號(hào)和新陸早28號(hào)，這2個(gè)品種均有貝爾斯諾的遺傳基礎(chǔ)；相似系數(shù)最低的2個(gè)品種是新陸早22號(hào)和新陸中60號(hào)，說(shuō)明它們之間的遺傳差異較大。

參照遺傳相似系數(shù)矩陣，采用類(lèi)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖2，在相似系數(shù)0.68處可將120個(gè)品種分為三大類(lèi)群。第一大類(lèi)群包含92份品種，其中48份新陸早系列，44份新陸中系列。從聚類(lèi)結(jié)果可以看出，具有相似遺傳背景的品種被聚在一起。新疆農(nóng)墾科學(xué)院選育出的新陸早42號(hào)和新陸早51號(hào)均含有新陸早10號(hào)的遺傳背景被聚成一類(lèi)；新陸早10號(hào)和新陸早15號(hào)均有中棉所12號(hào)的遺傳背景，也很好地聚為一類(lèi)；被聚在這一大類(lèi)群中的品種還有新陸早6號(hào)、新陸早16號(hào)、新陸早28號(hào)、新陸早25號(hào)、新陸早39號(hào)、新陸早9號(hào)、新陸早71號(hào)、新陸早27號(hào)以及新陸早79號(hào)，它們均含有貝爾斯諾的遺傳背景；新陸中40號(hào)和新陸中42號(hào)的遺傳背景相似被聚在一起。此外，選育單位相同的品種也被聚為一類(lèi)，由新疆康地種業(yè)選育的新陸中31號(hào)、新陸中39號(hào)，新疆巴州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的新陸中41號(hào)、新陸中47號(hào)，新疆農(nóng)墾科學(xué)院選育的新陸早40號(hào)、新陸早60號(hào)均被聚在一起，說(shuō)明各育種單位在品種選育時(shí)所采用的親本材料遺傳基礎(chǔ)較狹窄，在環(huán)境壓力和人為選擇作用下使得相同單位選育的品種具有較高的相似度。第二大類(lèi)群僅包含12個(gè)品種，其中10份為新陸早系列，2份為新陸中系列。由新疆農(nóng)墾科學(xué)院選育的新陸早32號(hào)、新陸早44號(hào)及新陸早45號(hào)被聚在第二類(lèi)群；其中新陸早45號(hào)是利用新陸早13號(hào)做母本，以9941做父本雜交選育而來(lái)，因此也被聚在了這一類(lèi)群中。第三大類(lèi)群包含16份品種，其中4份為新陸早系列，12份為新陸中系列。從聚類(lèi)圖中看出，相同選育單位的品種被聚在了一起，由新疆康地種業(yè)選育的新陸中25號(hào)、新陸中38號(hào)，新疆巴州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的新陸中63、新陸中64，農(nóng)一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所和塔河種業(yè)選育的新陸中48、新陸中60及新陸中62均被聚在第三類(lèi)群。

圖2 120份棉花品種的UPGMA聚類(lèi)分析圖Fig.2 UPGMA clustering analysis figure of 120 cotton cultivars

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了品種鑒定方法的不斷進(jìn)步，通過(guò)構(gòu)建DNA指紋圖譜快速鑒別品種真實(shí)性和純度，已成為當(dāng)今品種鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，其中SSR標(biāo)記被認(rèn)為是品種鑒定較為理想的標(biāo)記之一[16]。品種DNA指紋圖譜鑒定主要有3種方法，具體包括特征譜帶法、引物組合法和核心引物組合法。120個(gè)供試材料中17個(gè)品種在24個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)上具有特征譜帶，在構(gòu)建品種DNA指紋圖譜時(shí)，使用起來(lái)簡(jiǎn)單快速。但就本研究而言，只有少部分品種具有特征引物，若要獲得更多品種的特征引物還需進(jìn)行大量的引物篩選工作，且隨著品種數(shù)量的增加，原來(lái)在某品種上表現(xiàn)為特征譜帶的引物，有可能在其它品種上出現(xiàn)相同的帶型，即特征譜帶是相對(duì)的，只有在固定的材料范圍內(nèi)有效，鑒別能力相對(duì)有限。

在進(jìn)行品種鑒別時(shí)，通常會(huì)利用盡可能少的標(biāo)記以鑒別最多的品種。其中，核心引物組合法在構(gòu)建作物DNA指紋圖譜時(shí)十分有效。在棉花DNA指紋圖譜構(gòu)建中，韓宗福等[17]、張玉翠等[9]、聶新輝等[8]進(jìn)一步驗(yàn)證了核心SSR引物組合的適用性。通過(guò)不同引物的組合，可以大大提高引物的鑒別能力，本研究采用12對(duì)引物可將120個(gè)棉花品種完全區(qū)分開(kāi)。但今后隨著棉花種質(zhì)資源的不斷豐富，這12對(duì)引物的鑒別能力可能會(huì)有所下降，因此可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)更換引物或增加引物數(shù)目，這與李成奇等[18]研究一致。

目前，SSR指紋圖譜有各式各樣的表達(dá)方式[19-22]。最常見(jiàn)的是電泳圖譜，即直接用擴(kuò)增得到的電泳膠片代表品種的指紋信息。張玉翠等[9-10]利用這種方法，對(duì)32個(gè)棉花主栽品種進(jìn)行了指紋圖譜的構(gòu)建。其次，還可以根據(jù)分子量片段的大小，估算目的條帶的大小以建立品種指紋數(shù)據(jù)。葉春秀等[23]采用該方法對(duì)41個(gè)早熟陸地棉品種進(jìn)行了指紋圖譜研究。除此之外，另1種常見(jiàn)的方法是以01數(shù)字串記錄品種指紋信息，即用擴(kuò)增得到的01數(shù)據(jù)組合直接表示品種指紋。其中，薛艷等[24]利用該方法構(gòu)建了42份新疆早熟棉的SSR指紋圖譜。本研究所選用的材料數(shù)量較為全面，共計(jì)120個(gè)品種，要區(qū)分這些材料所需引物數(shù)目為12對(duì)。如果直接用01數(shù)據(jù)表示品種的指紋圖譜，數(shù)據(jù)較為龐大，記錄觀(guān)察不方便，因此我們對(duì)擴(kuò)增得到的01數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制，構(gòu)建了以上試驗(yàn)材料的數(shù)字指紋。

應(yīng)用NTSYS-pc v2.1對(duì)其遺傳多樣性水平作出評(píng)價(jià)，聚類(lèi)結(jié)果與系譜來(lái)源具有較高的相關(guān)性，在相似系數(shù)0.68處，所有的品種被分為三大類(lèi)群。120個(gè)新疆陸地棉品種遺傳相似系數(shù)矩陣和聚類(lèi)結(jié)果表明，新疆陸地棉品種之間遺傳多樣性水平較低，說(shuō)明品種之間遺傳背景差異不大，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較窄，總體上遺傳多樣性不夠豐富，這與聶新輝等的研究結(jié)果相似[8]。

4 結(jié)論

以近40年間新疆審定的120個(gè)陸地棉品種為材料，從586對(duì)SSR候選引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、均勻分布于棉花26條染色體的78對(duì)核心引物。這些SSR核心引物對(duì)新疆陸地棉品種具有良好的區(qū)分能力，通過(guò)12對(duì)多態(tài)性引物組合構(gòu)建了120個(gè)新疆陸地棉品種指紋圖譜，將120個(gè)陸地棉品種聚為3大類(lèi)型，遺傳多樣性較狹窄。構(gòu)建的指紋圖譜可為今后新疆陸地棉種質(zhì)資源保護(hù)和品種鑒定奠定了基礎(chǔ)。