王文濤，李天柱，楊 霄

（1.赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院；2.赤峰制藥股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)是一門以實(shí)驗(yàn)技術(shù)為支撐的學(xué)科，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是其中重要的一類實(shí)驗(yàn).肺炎鏈球菌簡(jiǎn)稱肺炎球菌，在自然界中分布廣泛，可以在5－10%的健康成人及20－40%兒童的鼻咽內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在某一些環(huán)境，尤其是一些經(jīng)常與人接觸的地方（如醫(yī)院或軍營(yíng)），可以發(fā)現(xiàn)更多的數(shù)量.多數(shù)不致病或致病力很弱，少數(shù)致病力較強(qiáng)，其能否致病與莢膜有密切關(guān)系，因莢膜能抵抗人體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬作用而致細(xì)菌大量繁殖，是細(xì)菌性大葉性肺炎的主要病原體.肺炎球菌莢膜在小白鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)是重要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之一，其實(shí)驗(yàn)過程是很復(fù)雜的，在實(shí)驗(yàn)過程中遇到一些問題，并總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn).

1 培養(yǎng)基制備

1.1 液體培養(yǎng)基的制備

以無菌方式加無菌脫纖維羊血5ml于高壓滅菌后冷卻到50℃的營(yíng)肉湯培養(yǎng)基100ml中，混勻后分裝滅菌試管每支3ml左右，置35℃溫箱中過夜，證明無菌后使用.因此菌營(yíng)養(yǎng)要求高，所以加血的量可多一些.

1.2 固體培養(yǎng)基的制備

將血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，68.95Kpa高壓滅菌15min,冷卻50℃時(shí)加入5-10%脫纖維羊血混勻，傾注無菌平板，備用.此培養(yǎng)基的制備過程一定要注意無菌操作.

2 菌種準(zhǔn)備

2.1 菌種的篩選

菌種要選用肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，其編號(hào)為CMCC31001.因標(biāo)準(zhǔn)菌株有典型生物學(xué)特性，這對(duì)此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是非常重要的.

2.2 菌種的接種與傳代

肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為真空凍干粉，取出后恢復(fù)室溫，用75℅酒精消毒管外壁，用砂輪環(huán)形劃線，用手掰開，用吸管吸取血肉湯培養(yǎng)基0.3ml左右注入被啟開的菌種安瓶中吹打，使凍干菌種溶解成混懸液.將混懸液全部吸出注入血平板和血肉湯管中，放置在5-10%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18-24小時(shí).次日觀察菌種的生長(zhǎng)情況，如菌種未生長(zhǎng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)，如果平板沒長(zhǎng)，肉湯管長(zhǎng)了，可以取肉湯管做分離培養(yǎng).

2.3 菌種的鑒定

復(fù)蘇后的肺炎菌種在傳1-2代后，觀察菌落特點(diǎn)，做革蘭氏染色及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肺炎菌的生物學(xué)特性相吻合后，才可以繼續(xù)做小白鼠接種.

2.3.1 菌落觀察

將待檢菌接種在血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察菌落.該菌落直徑0-1.0mm、灰白色、半透明表面光滑的扁平菌落、周圍環(huán)繞著草綠色溶血環(huán).培養(yǎng)24小時(shí)以上的培養(yǎng)物，其菌落中央可凹陷致邊緣凸起而呈臍窩狀.

2.3.2 形態(tài)觀察

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：

（1）初染 結(jié)晶紫染1分鐘，水洗.

（2）媒染 加盧戈碘液1分鐘，水洗.

（3）脫色 加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30秒后水洗.

（4）復(fù)染 沙黃染色液染1分鐘后，水洗，干燥，鏡檢.

該菌染色結(jié)果為矛頭狀、成雙排列、坦面相鄰尖端向外，革蘭氏陽(yáng)性球菌.

2.3.3 生化反應(yīng)

（1）觸酶試驗(yàn)：該菌觸酶試驗(yàn)陰性為鏈球菌屬.

（2）CAMP試驗(yàn)

在羊血平板上，用金黃色葡萄球菌劃種一條橫線，再將被檢菌距離金黃色葡萄球菌接種線3mm處成直角接種一條短線，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果.該菌CAMP試驗(yàn)陰性.

（3）Optochin敏感試驗(yàn)

挑取待檢菌密集劃線接種于血瓊脂平板，貼放Optochin紙片，35℃孵育18-24小時(shí)，觀察抑菌環(huán)大小，該菌抑菌環(huán)為17mm，≥14mm為敏感.

（4）膽汁溶菌試驗(yàn)

在培養(yǎng)的血瓊脂平板上選擇出待檢的呈草綠色溶血的菌落觀察記錄菌落特點(diǎn)后，然后與菌落上滴加1滴100g/L去氧膽酸鈉溶液35℃孵育15-30分鐘后，該菌落消失，膽汁溶菌試驗(yàn)陽(yáng)性.

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肺炎菌的生物學(xué)特性相吻合后，鑒定結(jié)果為肺炎鏈球菌，可以繼續(xù)做小白鼠接種.

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備

3.1 動(dòng)物選擇清潔級(jí)普通動(dòng)物，是指一級(jí)動(dòng)物應(yīng)排除的病原體外，不攜帶對(duì)動(dòng)物危害大和對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體動(dòng)物.因?yàn)樾“资髮?duì)肺炎球菌的毒力甚為敏感，所以實(shí)驗(yàn)選擇健康小白鼠，最好選擇雄性，16-20克，太大和太小都影響莢膜的形成.

3.2 小白鼠在實(shí)驗(yàn)前不要喂養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，過長(zhǎng)以后小白鼠體重會(huì)增加，也會(huì)影響莢膜的形成.

4 小白鼠肺炎模型設(shè)計(jì)與操作

4.1 菌懸液制備

將鑒定后的細(xì)菌做增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3代后做小白鼠接種，這樣做雖然保證了菌量，但是大大增加了其它細(xì)菌的污染機(jī)會(huì)，因肺炎鏈球菌比較脆弱，其它細(xì)菌的大量生長(zhǎng)可能會(huì)抑制它的生長(zhǎng).所以為了避免以上問題的出現(xiàn)，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，采用了以下的方法.

將肺炎鏈球菌24小時(shí)血瓊脂平板培養(yǎng)后直接接種到血肉湯培養(yǎng)液中稀釋成10*108cfu/ml混勻，不經(jīng)過培養(yǎng)直接給小白鼠注射.

4.2 模型的設(shè)計(jì)

為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，我們根據(jù)注射的劑量將小白鼠分為三組，第一組6只每只腹腔注射0.1ml，第二組6只每只腹腔注射0.2ml，第三組6只每只腹腔注射0.3ml，注射完做好標(biāo)記，飼養(yǎng)2-5天，在飼養(yǎng)過程中要給小白鼠充足的水和食物，并且注意室內(nèi)的溫度在25℃以上，小白鼠情況，如有多數(shù)死亡立即解剖，一般在3-5天死亡，如有個(gè)別先死亡的，放到袋里做好時(shí)間和注射量的標(biāo)記，放到冰箱冷藏，千萬不要冷凍，因?yàn)閮鋈跁?huì)使肺炎鏈球菌自溶，和大批死亡的小鼠一起解剖.

4.3 小白鼠腹腔注射

小白鼠腹腔注射也一定要注意無菌操作.首先要準(zhǔn)備好菌懸液、小白鼠、注射器、碘伏、棉簽等.第二抽吸菌液一定要混勻后抽吸，不要有氣泡，以免造成注射量的不準(zhǔn).第三要固定好小白鼠，以免小白鼠的腿活動(dòng)使菌液濺到外面造成環(huán)境污染.第四給小白鼠腹部消毒，消毒面積不能過小.第五注射，注射時(shí)應(yīng)選擇在腹中線兩側(cè)，進(jìn)針時(shí)慢慢刺入腹腔，不得過深，先斜著進(jìn)針然后再垂直進(jìn)以免拔針時(shí)菌液流出.

5 動(dòng)物解剖

5.1 解剖前準(zhǔn)備

需要小鼠解剖板、方盤、大頭針、消毒液、手術(shù)刀、手術(shù)剪、止血鉗、眼科鑷子、棉簽等.

5.2 解剖做臟器印片

a.首先將方盤里倒上3/2的消毒液，將已死或處死小鼠放在消毒液中浸泡4-5分鐘后用大頭針將小白鼠的四肢固定在解剖板上.

b.左手持鉤鑷將小白鼠下腹部皮膚提起，再用右手持剪刀剪一開口，剪開皮膚及腹膜，向上至鎖骨，向下至恥骨，暴腹腔臟器，再用手術(shù)剪，剪斷兩側(cè)肋骨暴露胸腔臟器.

c.以肺、肝、脾、腎的順序?qū)⒏髋K器剪開一切面，將滲出液涂在玻片上自然干燥.

d.將干燥后的玻片做革蘭染色，染完后印干鏡檢.

5.3 解剖后動(dòng)物及器械的處理

將解剖后的小鼠及臟器放進(jìn)塑料袋中，放進(jìn)高壓鍋中進(jìn)行高壓滅菌.把用過的器械放在消毒液中浸泡40分鐘，然后刷洗，放溫箱烘干.

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察

將染好的玻片放在顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找出細(xì)菌，然后在第一個(gè)膜上滴一滴香柏油，將鏡頭轉(zhuǎn)到油鏡，調(diào)微調(diào)使鏡物相清晰，鏡下可見肺炎球菌呈矛頭狀，成雙排列，尖端向外，鈍端相接菌體周圍可見橢圓形無色透明區(qū)域?yàn)榍v膜.下圖為各臟器印片革蘭染色鏡下10*100所拍的照片（A:肺臟印片、B:肝臟印片、C:脾臟印片、D：腎臟印片）.

7 分析與討論

通過以上實(shí)驗(yàn)過程可以看出肺炎球菌莢膜在小白鼠體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)是個(gè)很復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)涉及很多實(shí)驗(yàn)技術(shù)，所有的操作過程應(yīng)盡量細(xì)心，避免產(chǎn)生或?yàn)R出氣溶膠，所有培養(yǎng)物、儲(chǔ)存物及其他規(guī)定的廢棄物在釋放前均應(yīng)使用可行的消毒方法進(jìn)行消毒，如高壓滅菌.

綜上所述，莢膜是肺炎鏈球菌主要的致病因素，有莢膜的肺炎鏈球菌可抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬，有利于細(xì)菌在體內(nèi)定居并繁殖.通過有莢膜菌株接種小白鼠，接種后12-36小時(shí)，小白鼠死亡.通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一些問題，并做出了一些改進(jìn)，使實(shí)驗(yàn)預(yù)期更加穩(wěn)定.從這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以看出，一個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功有很多影響因素，特別是醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這就需要我們實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)過程中，不斷地發(fā)現(xiàn)和探索，進(jìn)一步改進(jìn)和更新.