王 靜，蔣惠宇，張晶晶,張 華，彭孝軍

(1.大連理工大學(xué) 化工學(xué)院，遼寧 大連 116024;2.精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連理工大學(xué)，遼寧 大連 116024;3.北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所,北京 100054)

養(yǎng)心氏片是由黃芪、靈芝、黨參、丹參、葛根、地黃、當(dāng)歸、淫羊藿、延胡索(炙)、山楂、甘草(炙)、黃連、人參 13 味中藥組成的中成藥，具有扶正固本、益氣養(yǎng)血、通脈止痛等功效[1]。臨床研究表明，養(yǎng)心氏片對(duì)心絞痛、冠心病、心力衰竭等疾病具有顯著療效[2-4]，可改善冠心病患者左心室收縮及舒張功能,降低超敏C反應(yīng)蛋白水平，對(duì)冠狀動(dòng)脈具有保護(hù)作用[5-6]。養(yǎng)心氏片的臨床應(yīng)用安全性較高，不良事件發(fā)生率為0.17%[7-8]。作為復(fù)雜處方，養(yǎng)心氏片具有“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的作用特點(diǎn)[9]，但其心血管保護(hù)作用的機(jī)制尚未充分闡明，還必須依賴于養(yǎng)心氏片的主要化學(xué)成分構(gòu)成；對(duì)其化學(xué)成分的解析是加強(qiáng)養(yǎng)心氏片質(zhì)量控制和安全性、有效性的重要保障。目前針對(duì)養(yǎng)心氏片的分析，僅有運(yùn)用UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)進(jìn)行定性分析[9]或運(yùn)用HPLC方法對(duì)單一指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析的報(bào)道，Yang等[10]建立了養(yǎng)心氏片中葛根素含量的HPLC測(cè)定方法，測(cè)得3批次養(yǎng)心氏片中葛根素的含量為1.93～2.51 mg/片；Sun等[11]建立了養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷含量的HPLC/ELSD測(cè)定方法，發(fā)現(xiàn)3批次養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量為0.024%～0.027%。目前，關(guān)于養(yǎng)心氏片多組分化學(xué)成分同時(shí)定性及定量的分析方法尚未見報(bào)道。本研究利用高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù)，快速鑒定養(yǎng)心氏片化學(xué)成分；并采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)對(duì)其主要成分進(jìn)行定量分析，從而建立了高效快速的養(yǎng)心氏片化學(xué)成分的定性定量分析方法，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀 器

Agilent 6224型 TOF LC/MS系統(tǒng)，包括1290 Infinity LC系統(tǒng)和G6224A TOF MS系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫公司)；AB SCIEX QTRAP?4500 LC/MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)AB公司)；Shimadzu LC-20AD UFLC系統(tǒng)(日本島津公司);Elmasonic S60H通用型超聲波清洗儀(德國(guó)艾爾瑪公司)；MS105DU型精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試 劑

黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、葛根素、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、小檗堿、表小檗堿、黃連堿、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草苷(分析純，99%，普菲德生物技術(shù)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia有限公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)ACS恩科化學(xué))。所有試劑均為分析純以上，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)密理博公司)。養(yǎng)心氏片共10批，批號(hào)分別為160115、161101、161215、170601、151102、170702、170701、170210、171213、171111。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1HPLC-TOF/MS分析條件液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫程序：0～25 min，5%～35% A；25～45 min，35%～ 100% A；45～50 min，100% A；50～55 min，100%～ 5% A；55 ～60 min，5% A；流速0.2 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。質(zhì)譜條件：雙噴霧離子源(Dual ESI)，正/負(fù)離子掃描檢測(cè)方式；毛細(xì)管電壓為4 kV，碎裂電壓為150 V；干燥氣體溫度為350 ℃，干燥氣流速為 8 L/min，霧化氣壓力為35 psi。

1.3.2HPLC-MS/MS分析條件液相色譜條件：色譜柱為Waters XBridge?BEH C18(150 mm×4.6 mm,2.5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脫程序：0～10 min，25%～ 35% A；10～15 min，35%～100% A；15～20 min，100% A；20～21 min，100%～ 25% A；21～25 min，25% A；流速0.4 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子切換掃描檢測(cè)方式，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Scheduled MRM)；離子化電壓(IS)5.5 kV/-4.5 kV；溫度為500 ℃；噴霧氣(GS1,N2)壓力為50 psi；輔助加熱氣(GS2,N2)壓力為60 psi；氣簾氣(CUR)壓力為20 psi；碰撞氣(CAD)設(shè)為Medium。

1.4 樣品溶液的配制

1.4.1對(duì)照品溶液的制備以甲醇為溶劑分別制備質(zhì)量濃度為40 mg/L的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參酮ⅡA、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、表小檗堿、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1儲(chǔ)備液；以甲醇為溶劑分別制備質(zhì)量濃度為1 g/L的小檗堿、黃連堿、丹酚酸B、甘草苷和葛根素儲(chǔ)備液。將以上儲(chǔ)備液存于4 ℃冰箱中待用。分別吸取各儲(chǔ)備液適量，制備混合對(duì)照品工作液。

1.4.2供試品溶液制備取養(yǎng)心氏片5片(批號(hào)161101)，去除糖衣，研磨成粉，過60目篩后，稱取200 mg樣品至200 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，并超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取上清液過0.2 μm濾膜，濾液待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的確定

考察了純甲醇、純乙醇以及不同比例的甲醇-水和乙醇-水對(duì)養(yǎng)心氏片中主要成分的提取率，結(jié)果表明純甲醇具有最高的提取率。同時(shí)，超聲(功率100 W，頻率40 kHz)輔助可以提高提取率。因此，確定提取方法為甲醇溶液超聲提取30 min。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的選擇

2.2.1色譜條件考察了分別以甲醇和乙腈為流動(dòng)相有機(jī)相的分離效果，結(jié)果表明，有機(jī)相為乙腈時(shí)，兩種分析方法的分離度均較理想，且在水相中加入0.1%甲酸后的色譜峰形優(yōu)于加入5 mmol/L乙酸銨，因此本文選擇乙腈-0.1%甲酸體系作為流動(dòng)相。在HPLC-TOF/MS分析中，采用具有較高分離效率的ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)色譜柱進(jìn)行分離，分析時(shí)間為60 min；在HPLC-MS/MS分析中，由于MRM模式具有較高的選擇性和靈敏度，為縮短分析時(shí)間，提高定量分析效率，選擇Waters XBridge?BEH C18(150 mm×4.6 mm,2.5 μm)色譜柱，在25 min內(nèi)可完成定量分析。

圖1 供試品的HPLC-TOF/MS總離子流圖Fig.1 HPLC-TOF/MS total ion chromatograms of the sample solutionthe peak number denoted was the same as that in Table 1

2.2.2質(zhì)譜條件樣品化學(xué)成分復(fù)雜，具有不同的質(zhì)譜行為，因此HPLC-TOF/MS采用正負(fù)離子分別掃描的方法。HPLC-TOF/MS分析中，正離子模式鑒定出22種化合物，負(fù)離子模式鑒定出24種化合物，共推測(cè)出30種化合物；在HPLC-MS/MS分析中，也采用正負(fù)離子切換掃描的模式。選擇Scheduled MRM監(jiān)測(cè)模式定量分析16種化合物，以提高分析效率和靈敏度，實(shí)現(xiàn)了多種化合物的同時(shí)測(cè)定，不同化合物在各自的通道被檢測(cè)，且未產(chǎn)生相互干擾。

2.3 養(yǎng)心氏片化學(xué)成分的鑒定

“1.4.2”制備的供試品溶液經(jīng)HPLC-TOF/MS分析，得到的總離子流圖見圖1。

根據(jù)總離子流圖所得到的化合物精確分子質(zhì)量信息，通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis(B.06.00)軟件在5×10-6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)匹配分子式，并與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)，對(duì)各化合物進(jìn)行初步鑒定，共推測(cè)得到30種化合物，詳細(xì)信息列于表1。利用已有的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，鑒別出黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參酮ⅡA等16種化學(xué)成分(圖2)。以正離子模式下的30號(hào)峰和負(fù)離子模式下的27號(hào)峰為例介紹鑒別過程。峰30和峰27的保留時(shí)間分別為43.12 min和29.90 min，質(zhì)荷比分別為295.133 3和829.458 6。

表1 養(yǎng)心氏片成分定性分析Table 1 The qualitative analysis of ingredient compounds in Yangxinshi tablets

圖2 對(duì)照品的總離子流圖
Fig.2 Total ion chromatograms of the reference substance the number denoted was the same as that in Table 1

利用Qualitative Analysis軟件，限定誤差<5 ×10-6，匹配可能的分子式，并對(duì)比參考文獻(xiàn)中已知化合物的質(zhì)荷比，確定峰30和峰27的分子式分別為C19H18O3和C41H68O14，加合峰分別為[M+H]+峰和[M+HCOO]-峰，與理論精確分子質(zhì)量(295.132 9和829.459 1)和同位素分布情況進(jìn)行比對(duì)，吻合良好(圖3)，推測(cè)峰30和峰27可能為丹參酮ⅡA和黃芪甲苷。最后，根據(jù)丹參酮ⅡA和黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的保留時(shí)間、精確分子量、同位素分布等信息，確定峰30和峰27為丹參酮ⅡA和黃芪甲苷。

2.4 養(yǎng)心氏片化學(xué)成分的定量分析

2.4.1線性關(guān)系將16種混合對(duì)照品溶液依次稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，取各濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，測(cè)定各化合物峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg·L-1)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。同法逐級(jí)稀釋，分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的進(jìn)樣濃度確定檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，如表2所示。16種分析物的線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.997，在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LOD為0.039 1～78.1 μg·L-1，LOQ為0.156～312 μg·L-1。根據(jù)《中國(guó)藥典》的規(guī)定：養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量不得少于50 μg/0.3 g,16種分析物的線性范圍和定量下限均可滿足養(yǎng)心氏片樣品的分析要求。

表2 16種分析物的保留時(shí)間、線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 2 Retention times(RT)，linear relations，limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 16 compounds

(續(xù)表2)

CompoundRT(min)Linear range(μg/L)Regression equationrLOD(μg/L)LOQ(μg/L)Epiberberine(表小檗堿)11.3062.5～2 000Y=67 200X-34 0000.997 00.4880.976Tetrahydropalmatin(延胡索乙素)11.506.25～200Y=201 000X+188 0000.998 30.1950.781Lithospermic acid B(丹酚酸B)11.80625～20 000Y=38.4X-10 7000.997 478.1312Coptisine(黃連堿)12.45156～5 000Y=29 300X+2 0300.999 60.3050.610Icariin(淫羊藿苷)13.36156～5 000Y=161X+46 5000.998 51.222.44Berberine(小檗堿)15.28625～20 000Y=8 110X+88 0000.997 40.1520.610Ginsenoside Rb1(人參皂苷Rb1)15.4415.6～500Y=147X-1580.998 30.7811.56Astragaloside Ⅳ(黃芪甲苷)15.99156～5 000Y=18.6X+2 1100.999 19.7619.5Tanshinone ⅡA(丹參酮ⅡA)21.740.625～20Y=204 000X+36 4000.999 90.039 10.156

2.4.2精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，16種分析物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%～3.8%，表明儀器的精密度良好。

取供試品溶液，分別置于4 ℃冰箱中0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，16種分析物的RSD為1.2%～3.4%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

取同一批次藥材(批號(hào)161101)，精確稱取200 mg，共6份，按照“1.4.2”方法制備供試品溶液，準(zhǔn)確吸取供試液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。6份樣品中，16種分析物的RSD為1.2%～3.7%，表明方法重復(fù)性良好。

精密稱取已知各成分含量的樣品200 mg，共6份，分別加入等量的對(duì)照品，按“1.4.2”方法制備供試品溶液，按“1.3”液相色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。6份樣品中，16種分析物的平均回收率為96.8%～103.8%，RSD為1.0% ～3.5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

分別稱取10批次樣品各200 mg，按“1.4.2”方法制備供試品溶液，按“1.3”液相色譜-質(zhì)譜條件各測(cè)定3次，得相應(yīng)色譜峰面積，代入回歸方程，計(jì)算16種成分的平均含量(表3,RSD≤4.4%)。對(duì)10批次養(yǎng)心氏片中16種成分進(jìn)行檢測(cè)，含量高于1 mg/g 片芯的化合物有黃芪甲苷、丹酚酸B、葛根素、小檗堿和黃連堿。上述5種化合物均具有顯著的抗炎、抗氧化等活性，體內(nèi)外研究證明其具有心血管保護(hù)活性[12-15]。《中國(guó)藥典》規(guī)定，養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量不得少于50 μg/0.3 g。根據(jù)本研究測(cè)定結(jié)果，10批次養(yǎng)心氏片中黃芪甲苷的含量均高于該標(biāo)準(zhǔn)，但不同批次樣品中各成分的含量存在一定差異，如小檗堿和黃連堿不同批次的含量差異可達(dá)6倍，這可能源于藥材在采摘、加工、炮制過程中產(chǎn)生的誤差，進(jìn)一步說明建立多指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定的中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制方法的必要性。

表3 10批次樣品中16種分析物的含量Table 3 Mean contents of 16 compounds in 10 batches

3 結(jié) 論

中藥化學(xué)成分研究是中藥現(xiàn)代化研究的基礎(chǔ)，本文建立了基于HPLC-TOF/MS的定性方法和基于HPLC-MS/MS的定量方法，對(duì)養(yǎng)心氏片中主要成分同時(shí)進(jìn)行了定性分析和定量分析。推斷鑒定了養(yǎng)心氏片中30種成分，并對(duì)其中16種主要成分進(jìn)行了HPLC-MS/MS定量分析。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為提高養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制提供了可行性方法，也為其藥理研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。該方法可作為中藥中多組分同時(shí)定性和定量分析的參考方法。此外，養(yǎng)心氏片在臨床上用于慢性心力衰竭等病癥療效顯著，但其作用機(jī)理尚不明確，因此本文建立的HPLC-TOF/MS和HPLC-MS/MS方法對(duì)于建立養(yǎng)心氏片化學(xué)成分庫，進(jìn)而闡明養(yǎng)心氏片抗心衰作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路也具有重要意義。