王培培，陳松燦，朱永官，3，孫國新*

（1.農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所生態(tài)毒理與環(huán)境修復研究中心，天津 300191；2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085；3.中國科學院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點實驗室，福建 廈門 361021）

砷（As）是一種全球分布廣泛的有毒類金屬元素。人類長時間的生產活動，如含砷采礦、金屬冶煉、化石燃燒以及含砷化學品過量使用等，導致大氣、土壤、河流和地下水等都遭受到了不同程度的砷污染[1-2]。稻米主要生產區(qū)（東南亞地區(qū)）的土壤和灌溉水中砷污染十分嚴重，這極易導致稻米中的砷過量積累。孟加拉國每公頃農田土壤每年約有10 kg砷通過灌溉或以大氣沉降的形式進入[3]。我國的稻米主產區(qū)湖南省多地的農田土壤砷含量高達每千克幾百毫克[4]。通過食物鏈傳遞以及地下水飲用等，砷污染已嚴重威脅到人類的身體健康[5-6]。砷污染問題促使砷的生物地球化學循環(huán)成為近年來的研究熱點。

自然界中的砷可以通過氧化還原作用、甲基化和去甲基化作用、配位體交換、顆粒物表面的化學和物理吸附、金屬離子共沉淀等過程引起其化學形態(tài)和物理狀態(tài)的改變[7-10]，如圖1所示，從而形成砷的生物地球化學循環(huán)。在自然條件下的土壤與水體環(huán)境中，砷主要以無機形態(tài)存在，如亞砷酸鹽As（Ⅲ）和砷酸鹽As（Ⅴ）。環(huán)境微生物能夠將無機砷轉化為有機砷形態(tài)[10-11]，此外藻類、植物和動物等也能使該過程發(fā)生。不同的是，哺乳動物甲基化砷的終產物是二甲基砷，而微生物甲基化砷的產物以三甲基砷為主[12-13]。有機砷主要有甲基砷化物、含硫甲基砷化物、含氯甲基砷化物等。甲基化砷一方面能被微生物脫甲基化生成無機砷[14-15]，另一方面則被進一步轉化為揮發(fā)的甲基砷氫化合物（單甲基砷氫化物MMAsH2，二甲基砷氫化物DMAsH，三甲基砷TMAs），形成砷的揮發(fā)過程。目前也有研究發(fā)現地熱環(huán)境釋放的砷氣中，除TMAs外，還存在甲基砷氯氣體以及甲基砷硫氣體[16]。

不同形態(tài)砷的生物有效性和毒性不同。一般對生物體而言，無機砷的毒性顯著高于有機砷。二甲基砷酸鹽DMAs（Ⅴ）和三甲基砷氧化物TMAsO的毒性均顯著低于As（Ⅲ）的毒性[17]，但是當DMAs（Ⅴ）和TMAsO被還原為二甲基亞砷酸鹽DMAs（Ⅲ）和三甲基砷TMAs（Ⅲ）（TMAs）后，毒性則大幅增加[18]。因此，當環(huán)境中或生物體內的無機砷被轉化為毒性較弱的有機砷或以氣體形式揮發(fā)到大氣中，一定程度上能夠降低砷的環(huán)境風險和健康毒害。砷甲基化過程是能有效調控砷污染行為的一個手段，值得深入研究。本文對微生物砷甲基化和揮發(fā)做了系統(tǒng)綜述，對后續(xù)研究工作有一定參考和指導意義。

1 微生物砷甲基化機理

十九世紀末期，人們就已經發(fā)現某些細菌和真菌可將無機砷轉化為有蒜臭味的氣體[19]。Challenger等[20]通過實驗證實了蒜臭味的砷氣體為三甲基砷（TMAs）。細胞內As（Ⅲ）在砷甲基轉移酶作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-Methionine，SAM）或者甲基鈷胺素（甲基維生素B12）作為甲基供體，將As（Ⅲ）轉化為一甲基砷和二甲基砷化合物，或者進一步生成揮發(fā)性的三甲基砷化物TMAs等。目前已發(fā)現多種微生物能通過甲基化過程將砷揮發(fā)到大氣中，包括多種真菌、細菌、古菌、真核藻類、原生動物以及哺乳動物及人體細胞中均有報道。但是他們揮發(fā)砷的種類和數量不盡相同[10]。

圖1 環(huán)境砷各種物理和化學形態(tài)之間的相互轉化[10]Figure 1 The transformation scheme of different physical and chemical arsenic species in the environment[10]

砷甲基轉移酶首先在大鼠體內發(fā)現[21-23]。隨著微生物基因組測序技術的發(fā)展，在微生物中已識別了多種砷甲基轉移酶同源基因。Chen等[24]利用ArsM的直系同源蛋白序列構建了ArsM系統(tǒng)發(fā)育樹。在ArsM發(fā)育樹中，上述六個類群的ArsM序列聚類成六枝可靠性較高（Bootstrap＞50）的進化分支。Qin等[25-26]從革蘭氏陰性細菌Rhodopseudomonas palustris CGA009和嗜熱紅藻Cyanidioschyzon sp.5508基因組中分別克隆到了arsM同源基因并驗證了其生理功能。原生動物四膜蟲Tetrahymena pyriformis[27]、硫還原菌Clostridium sp.BXM[28]、產甲烷古菌Methano?sarcina acetivorans C2A[29]、噬纖維菌屬Cytophagaceae sp.SM-1[30]的arsM基因及功能也被報道，并詳細研究。藍藻中的砷甲基化基因相對復雜，屬于不同的類群（第一和第二類群），Yin等[31]成功克隆了三種淡水 藍 藻（Synechocystis sp.PCC 6803，Microcystis sp.PCC 7806，Nostoc sp.PCC 7120）中arsM同源基因，并對其功能進行了表征。

通過對比所有已報道的砷甲基轉移酶的氨基酸序列可以看出，這些蛋白的長度大約在248～400個氨基酸之間[32]。雖然砷甲基轉移酶可以分為多個類群，但所有砷甲基轉移酶都存在著一些非常保守的區(qū)域。這些保守區(qū)域大約位于中間的150個氨基酸左右，都有保守的半胱氨酸位點。其中一些保守區(qū)域可能參與和SAM之間的相互作用，但目前還沒有直接證據的報道[32]。另一些保守區(qū)域被證明參與砷的結合與甲基化。例如藍藻Synechocystis sp.PCC6803甲基化酶序列中第48、143和195位置處的半胱氨酸是保守的[33]。硫酸鹽還原細菌Clostridium sp.BXM中，甲基化酶序列第65、153和203位置處的半胱氨酸是保守的[28]。而產甲烷八疊球菌Methanosarcina acetivorans C2A甲基化酶第62、150和200位置的半胱氨酸為保守氨基酸[29]。已有研究證明這些保守半胱氨酸在結合As（Ⅲ）及砷甲基化中起非常關鍵的作用[33]。然而最近有研究發(fā)現，Bacillus sp.CX-1菌株的甲基化酶僅有兩個保守的半胱氨酸位點在砷甲基化過程中發(fā)揮作用[34]。在一般的保守區(qū)域以外，這些甲基轉移酶序列的多態(tài)性可能決定了酶的功能特異性，它們的作用有待于進一步研究。

2 砷甲基化基因的進化

砷的生物甲基化在自然界中非常普遍，砷甲基化基因（arsM）廣泛分布于不同門類物種的基因組中。Chen等[24]利用生物信息學的方法搜索了EggNOG數據庫收錄的2031個物種中ArsM的直系同源蛋白（Ortholog），發(fā)現ArsM直系同源蛋白在細菌、古菌以及真核生物等三域（Domain）中均有分布，見圖2。根據序列相似性，ArsM同源蛋白大致聚成六個類群（Group），各個類群內的ArsM蛋白序列相較于不同類群間具有更高的序列相似性。第一個類群包括藍藻門（Cyanobacteria）以及擬桿菌門（Bacteroidetes）的ArsM；第二個類群的ArsM主要來自藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）以及變形菌門（Proteobacteria）的微生物；第三個ArsM類群由動物（Metazoan）、原生生物（Protist）、紅藻（Red algae）等真核生物以及變形菌門（Proteobacteria）等原核生物組成；第四個ArsM類群來源于真菌（Fungi）以及浮霉菌門（Planctomycetes）；第五個類群的微生物聚類了厭氧細菌中的ArsM，包括綠菌門（Chlorobi）以及厭氧變形菌門（Proteobacteria）的細菌；第六類ArsM由不同門類的細菌以及古菌構成。arsM同源基因序列聚類的結果表明來自不同域物種的ArsM具有較高的序列相似性（第三類群和第四類群），這暗示arsM基因可能存在跨域物種間基因水平轉移（Inter-domain horizontal gene transfer）。

圖2 砷甲基轉移酶ArsM系統(tǒng)發(fā)育樹[24]Figure 2 Phylogeny of ArsMs-As（Ⅲ）SAM methyltransferases[24]

利用ArsM的直系同源蛋白序列構建了ArsM系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。對六個系統(tǒng)發(fā)育分支進一步分析表明，ArsM可能起源于25億年前發(fā)生的大氧化事件（Great Oxidation Event，GOE）之前。在ArsM系統(tǒng)發(fā)育樹第一分支中，藍藻門的最基部類群紫色粘桿菌（Gloeo?bacter violaceus）在ArsM系統(tǒng)發(fā)育樹相較于其他藍藻類群處于最基部，這表明ArsM可能存在于藍藻的共同祖先（Least Cyanobacterial Common Ancestor，LCCA）中（圖3）。對于ArsM系統(tǒng)發(fā)育樹其他分支的分析表明，跨域物種間基因水平轉移可能在ArsM的進化歷史中發(fā)揮過重要的作用。比如，動物甲基化酶AS3MT與變形菌門來源的ArsM在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個單系群（第三類群），這暗示動物的甲基化酶可能來源于細菌。進一步分析arsM直系同源基因在動物中的分布以及其系統(tǒng)發(fā)育分支，推測arsM基因從細菌到動物的水平轉移時間大約距今6.35億年。類似的，真菌中的AS3MT直系同源基因也可能來源于細菌的水平轉移（第四類群）。通過系統(tǒng)分析ArsM進化樹上的各個分支，推測跨域物種間基因水平轉移事件在物種演化過程中至少發(fā)生過6次。ArsM在遠緣物種之間的頻繁基因水平轉移顯示其對于生命適應環(huán)境砷壓力的重要作用（圖3）。

3 砷甲基化機制的幾種預測

3.1 Challenger砷甲基化機制

圖3 砷甲基化基因arsM的跨域物種水平轉移示意圖[24]Figure 3 Diagram illustrating the inter-kingdom HGT of arsM gene（Horizontal lines and arrows show HGT donors and recipients.LCCA，last cyanobacterial common ancestor）[24]

Challenger等[36]提出了砷甲基化的第一個模型（圖4A）。甲基化過程為As（Ⅴ）→As（Ⅲ）→MMAs（Ⅴ）→MMAs（Ⅲ）→ DMAs（Ⅴ）→ DMAs（Ⅲ）。該模型認為：無機砷的甲基化過程是由三價砷化物的氧化甲基化與五價砷化物的還原交替進行的[37]。As（Ⅲ）在砷甲基轉移酶的催化下首先生成一甲基砷酸[MMAs（Ⅴ）]，生成的MMAs（Ⅴ）再被還原為MMAs（Ⅲ），之后進行氧化甲基化，MMAs（Ⅲ）被甲基化為二甲基砷酸[DMAs（Ⅴ）]，DMAs（Ⅴ）接著被還原為DMAs（Ⅲ），DMAs（Ⅲ）最終被甲基化為三甲基砷TMAs或四甲基砷。該模型未指出所需的甲基供體以及還原砷化合物所必需的還原劑或還原酶等。

但是在哺乳動物體內，還原型甲基化砷含量很低，MMAs（Ⅴ）→MMAs（Ⅲ）和DMAs（Ⅴ）→DMAs（Ⅲ）的過程可能很少發(fā)生。Cohen等[38]通過給大鼠喂食MMAs（Ⅴ）和DMAs（Ⅴ）研究五價甲基砷的還原。結果發(fā)現暴露于MMAs（Ⅴ）和DMAs（Ⅴ）的大鼠肝細胞中，只有極少部分的五價砷被還原為三價砷代謝產物[39]。Yamauchi等利用口服DMAs（Ⅴ）的大鼠，檢測發(fā)現體內的DMAs（Ⅴ）會立即從尿液中排出，而無任何還原發(fā)生[39]。這些表明甲基化過程中五價砷的還原存在一定爭議。

3.2 Hayakawa砷甲基化機制

Hayakawa等[40]提出了砷甲基化機制的第二個模型（圖4B）。該模型認為：還原型谷胱甘肽GSH與砷結合形成的復合體是甲基轉移酶的最適合底物，而不是三價砷本身作為酶的底物。與Challenger模型不同的是，該模型認為一系列甲基化反應是連續(xù)進行的，中間不涉及氧化還原價態(tài)的變化。體內S腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基化過程中的甲基供體。As（Ⅲ）與GSH形成的復合體As（GS）3被甲基化生成MMAs（GS）2和 DMAs（GS）。MMAs（GS）2和 DMAs（GS）通過解離生成MMAs（Ⅲ）和DMAs（Ⅲ），這些還原型甲基砷化合物很不穩(wěn)定，很快被氧化生成DMAs（Ⅴ）和MMAs（Ⅴ）（圖 4B）。

該模型目前也存在一些爭議，比如GSH與砷化合物結合產生的復合物形態(tài)，尚無可靠的實驗證據。體外實驗表明，當體系中沒有酶蛋白時，通過色譜分析（陰離子交換柱）能檢測到As（Ⅲ）和MMAs（Ⅲ）與GSH的結合態(tài)，即As（GS）3和MMAs（GS）2形態(tài)，但當添加了砷甲基轉移酶后，之前檢測到的As（GS）3和MMAs（GS）2復合物則消失，推測是大部分的三價砷化合物與砷甲基轉移酶的結合取代了與GSH的結合[41]。

3.3 Naranmandura砷甲基化機制

Naranmandura等[42]提出了第三種砷甲基化機制（圖4C）。該機制認為三價砷被生物體吸收后，首先與蛋白質結合成復合物，而非與GSH結合，然后經還原甲基化過程，生成MMAs（Ⅲ）和DMAs（Ⅲ），三價甲基砷化合物不穩(wěn)定，最后被氧化生成五價的甲基砷產物（圖4C）。甲基化過程需要SAM和GSH的參與，前者屬于甲基供體，后者可能起到還原三價砷的作用。該模型與Hayakawa砷甲基化模型的相同點在于，都認為MMAs（Ⅴ）和DMAs（Ⅴ）是砷甲基化過程的終產物，而不是中間產物；不同之處在于，由于蛋白上的巰基比非蛋白化合物（GSH）上的巰基更加穩(wěn)定[12，43-45]，所以該模型認為蛋白巰基更容易與三價砷化物結合成復合物進行反應[45-48]。

圖4 微生物中預測的幾種砷甲基化機制[37]Figure 4 Proposed methylation pathways for inorganic As in the microorganism[37]

3.4 甲基鈷胺素依賴的非酶砷甲基化機制

在GSH存在條件下，甲基鈷胺素[即甲基維生素B12，CH3Cob（Ⅲ）]和As（Ⅲ）能夠在體外生成單甲基砷和少量二甲基砷，這個過程不需要酶的參與[36，49]（圖4D）。向體系中加入肝臟細胞勻漿（其內沒有檢測到砷甲基轉移酶蛋白），對這種甲基鈷胺素依賴的砷甲基化過程既沒有抑制作用也沒有促進作用。此外，在產甲烷古菌中，砷的甲基化過程還可能與甲烷生成途徑密切相關。Thomas等[50]報道了產甲烷古菌Methanosarcina mazei中多種（類）金屬（包括砷）的甲基化不是依賴于金屬特異性的甲基轉移酶來完成的，而是與甲烷生成過程中的主要輔酶甲基鈷胺素和它的去甲基化代謝產物鈷胺素[Cob（I）]參與的反應相耦合進行的。

4 環(huán)境中砷揮發(fā)及影響因素

砷甲基化和揮發(fā)是砷的生物地球化學循環(huán)的重要組成部分。但目前砷由陸地或海洋生態(tài)系統(tǒng)向大氣中的揮發(fā)效率的研究十分有限[51]。Savage等[52-53]研究了海洋體系中砷的揮發(fā)。海水中揮發(fā)砷的產生可能主要源于海水中的有機砷，揮發(fā)砷產物主要是TMAs和少量的DMAsH。研究發(fā)現海水發(fā)源地的海岸沉積物中普遍存在著TMAO和DMAs（Ⅴ），這些砷化合物向海水的砷輸入率（0.3～0.5 nmol·m-2·d-1）與海水中砷的揮發(fā)率（0.9 nmol·m-2·d-1）在同一個數量級，說明二者可能存在相關性。海水經過兩周的培養(yǎng)時間，大約0.04%的總砷能被揮發(fā)出去。Zhang等[54]研究了海洋微藻類生物能夠將無機砷轉化成氣態(tài)砷，并且三價砷的揮發(fā)效率顯著高于五價砷。Mestrot等[55-56]對陸地系統(tǒng)土壤（尾礦，稻田土壤，河口沉積物或泥炭土）的砷揮發(fā)做了分析，砷揮發(fā)的速率在（0.5±0.2）與（69.2±33.1）μg·kg-1·a-1之間，而泥炭土的砷移除率可達0.17%。Turpeinen等[57]分析了三種高砷污染（2125～3632 mg·kg-1）沙土的砷揮發(fā)率在0.02%～0.3%之間。所有土壤的揮發(fā)砷都以TMAs為主，伴隨少量的DMAsH和AsH3。從目前的研究來看，自然土壤中揮發(fā)的砷量一般在1%以下。陸地系統(tǒng)揮發(fā)的砷量可能高于海洋系統(tǒng)。有關砷揮發(fā)的試驗表明，砷揮發(fā)的水平與體系中的營養(yǎng)條件和微生物活性有直接的關系。土壤的微生物豐度和多樣性高于海洋系統(tǒng)，有利于解釋陸地系統(tǒng)中砷揮發(fā)量更高的原因[58]。有機物質例如糞肥等的添加可以明顯促進土壤砷的揮發(fā)[59-60]，外來物質的添加可能增加了體系中的微生物多樣性和豐度，包括砷甲基化微生物，因此引起砷揮發(fā)的升高。三葉草和酒糟的添加可以大幅提高水稻土的砷揮發(fā)量，然而，滅菌和非滅菌的酒糟添加物對砷揮發(fā)的影響沒有顯著性差異，說明酒糟攜帶的外來微生物沒有對砷揮發(fā)產生明顯影響[61]。也可能是酒糟添加提高了土著微生物的生長活性，其中砷甲基化微生物豐度的顯著增加提高了砷揮發(fā)效率。一些非生物條件也可以顯著影響砷揮發(fā)效率，包括砷底物的形態(tài)、濃度、土壤濕度、溫度、氧化還原電勢和pH等[59，62-63]。外界條件的改變對砷揮發(fā)的影響，可能一方面歸因于對微生物活性的影響，另一方面歸于對砷化合物反應過程的調控，例如氧化還原電勢和pH等都能夠影響酶學反應效率。Chen等[64]向水稻土中添加了鉬酸鹽后顯著提高了土壤砷揮發(fā)量，鉬酸鹽改變了土壤的微生物群落結構，增加了甲基砷還原微生物的豐度，上調了砷還原酶基因的表達，進而將更多的甲基砷酸鹽轉變?yōu)榧谆闅鈸]發(fā)出去。此外，最近有學者克隆了砷的脫甲基化基因[14-15]，砷的脫甲基化過程可能同時存在于土壤環(huán)境中，從而抑制土壤的砷揮發(fā)比率。目前對砷揮發(fā)的影響機制，以及砷甲基化和脫甲基化的動態(tài)機制，認知還有限，缺乏系統(tǒng)研究，有待進一步探索。

微生物的砷甲基化及揮發(fā)不但使砷的生物地球化學循環(huán)成為可能，也能達到降低環(huán)境中的砷毒害、修復砷污染環(huán)境的目的。目前國際上對重金屬污染問題倡導“綠色可持續(xù)修復”理念（ITRC）[65]。鑒于生物修復能較好保持土壤結構和生態(tài)平衡，并具有成本低、環(huán)境友好和簡便易行等優(yōu)點，重金屬修復由物理和化學手段逐漸向生物修復的方向發(fā)展。微生物的砷揮發(fā)作用可能是一種具有應用前景的砷污染生物修復技術[66-68]。然而，已報道微生物的砷揮發(fā)量都比較微弱，一方面可能源于微生物本身的揮發(fā)能力低，另一方面可能由于甲基化微生物在環(huán)境中的生物量較低。Huang等[30]從砷污染水稻土中分離出砷甲基化能力很強的Cytophagaceae sp.SM-1菌株。水稻土本身甲基化和揮發(fā)砷的能力很低，而一旦添加了富集培養(yǎng)的SM-1后，土壤的甲基化和揮發(fā)能力都顯著提高，揮發(fā)砷量與土壤中的SM-1菌豐度呈現正相關。為了提高生物修復效率，目前諸多研究采用生物工程改造菌的手段，促進砷揮發(fā)。在染色體上穩(wěn)定表達外來arsM基因的Pseudomonas putida KT2440工程菌，能夠將土壤的砷揮發(fā)量提高9倍，增加土壤中砷的生物有效性之后，揮發(fā)砷含量提高至49倍[66]。這也進一步說明了生物和非生物因素共同決定了土壤的砷揮發(fā)效率。此外，微生物和植物聯合修復的手段也有一定前景，Zhang等[69]將萊茵衣藻arsM基因轉入根瘤菌中表達，該菌與豆科植物形成共生體，體系甲基化無機砷量高達75%。而將萊茵衣藻arsM基因轉入擬南芥中，試圖通過基因工程植物進行修復時，轉基因植物雖然獲得了較強砷甲基化和一定的砷揮發(fā)能力，但對甲基砷毒性更加敏感，植物生物量顯著降低[70]。微生物-植物聯合修復手段的可行性有待進一步分析，值得深入研究。除了土壤修復，微生物修復還可以應用到工業(yè)污水和堆肥處理中，這些處理下釋放的砷氣體較易進行回收利用，減少砷的二次污染。地熱環(huán)境中生存的嗜熱藻Cyanidioschyzon sp.5508甲基化和揮發(fā)砷的最適溫度高達60～70℃，轉化和表達該藻arsM基因的耐高溫菌Bacillus subtilis 168經富集后被添加到50℃的堆肥處理中，顯著增加了砷揮發(fā)量[71]，一方面保障了堆肥安全利用，另一方面對投菌堆肥揮發(fā)的氣態(tài)砷加以收集處理，避免造成揮發(fā)砷的二次污染和可能的毒害作用。

5 研究展望

環(huán)境中砷的甲基化和揮發(fā)已被發(fā)現數十年，普遍認為微生物是驅動砷甲基化和揮發(fā)過程的主要因素。近十年，各種微生物的砷甲基化基因相繼被報道。而近兩年來，微生物砷甲基化研究已經不局限在純培養(yǎng)生物上，土壤或者水體中微生物群落結構多樣性和豐度與砷甲基化的聯系也開始被關注，更能綜合反映環(huán)境中砷甲基化的效率。未來的研究重點在于：（1）在分子水平上對微生物甲基化砷和脫甲基化砷的酶學機理進一步研究，研究砷甲基化基因的分子調控，探索抑制微生物脫甲基過程的因素，以提高微生物揮發(fā)砷的效率；（2）目前僅少數研究對環(huán)境中砷揮發(fā)量進行了原位監(jiān)測，多數研究還只局限在實驗室條件下分析砷揮發(fā)速率。因此，未來有必要對砷的揮發(fā)行為進行更多和更大范圍的原位監(jiān)測和模型預測，合理估測砷揮發(fā)對于全球范圍內砷的生物地球化學循環(huán)的貢獻率；（3）在更大的時間和空間尺度上研究砷揮發(fā)與各種環(huán)境因素的關系，這些研究將為利用砷揮發(fā)來原位修復環(huán)境砷污染提供可靠理論依據。