顏春魯 李盛華 郭愛軍 安方玉 劉永琦 宋敏 陳麗 王鵬 馬正民 牛彥強

1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 蘭州理工大學，甘肅 蘭州 730000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征，導致骨脆性增加和易于骨折的慢性代謝性骨病，起病比較隱匿[1]。尋找骨質疏松的防治方法成為醫(yī)學者關注的焦點。根據中醫(yī)學“腎主骨生髓”的理論，參照藤黃健骨膠囊的方劑組成(熟地黃、鹿銜草、骨碎補、肉蓯蓉、淫角藿、雞血藤、萊菔子)，我們推測藤黃健骨膠囊的補腎強骨活血作用有可能影響骨質疏松模型大鼠的骨代謝。鑒于此，我們采用去卵巢法建立骨質疏松大鼠模型，通過觀察其骨代謝生化指標，骨質微結構及骨密度等指標的變化，揭示藤黃健骨膠囊防治骨質疏松的作用機制，為藤黃健骨膠囊的臨床應用和后續(xù)開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

60只SPF級SD雌性大鼠，體重(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供。實驗動物質量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2主要試劑

水合氯醛(天津市光復精細化工研究所，批號：20150105)； Rat trACP ELISA Kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號：E20151102B)；Rat BGP ELISA Kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號：E20151201A)。

1.1.3主要儀器

iMark型自動酶標分析儀(美國Bio-Rad公司)；FA2004 N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；ZY12306型微量加樣器(ScienTiFic產品)；T6新悅-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(湖南平凡科技有限公司)；雙能X骨密度儀(GE公司，美國)；AG-IX生物力學萬能實驗機(島津公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1實驗藥物及給藥劑量

藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責任公司，國藥準字Z20123001，批號：503010)，人的臨床用量為：2 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法：2 g×0.018×5≈0.18 g/kg，作為中劑量。則藤黃健骨膠囊高、中、低劑量分別為0.36、0.18、0.09 g/kg；西藥對照組藥物為戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國藥準字J20130009，批號：156 A)；青霉素(華北制藥股份有限公司，國藥準字：H13020657，批號：F6042103)。

1.2.2動物分組、造模及給藥

參照文獻[2]，4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉動物體重，俯臥位，備皮，消毒手術區(qū)皮膚。沿背部后正中線作一1.0-1.5 cm的縱形切口乳白色發(fā)亮的脂肪團中找到棕黃色的卵巢，沿子宮角處結扎并切除卵巢，逐層縫合傷口。假手術組大鼠只切除卵巢周圍脂肪，其含量與卵巢重量一致。術后給予青霉素抗感染，大鼠術后注意保溫。造模成功12 w后，將SPF級SD雌性大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、模型組、西藥對照組(戊酸雌二醇片組)、藤黃健骨膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只，另設假手術組10只。給予藥物干預，西藥對照組給予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 mg/kg)灌胃治療，藤黃健骨膠囊藥物干預組按高、中、低劑量(0.36、0.18、0.09 g/kg)灌胃治療，假手術組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)4周[3,4]。

1.2.3指標測定

(1)動物一般狀況觀察：觀察并記錄各組大鼠體重，精神狀態(tài)，毛發(fā)，活動，飲食飲水，大小便等。

(2)骨代謝相關血清生化指標測定：末次給藥后，腹主動脈采血，靜置2-3 h，1500 rpm/min，離心10 min，分離血清。檢測各組動物血清骨鈣素(osteocalcin，BGP)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)等指標。具體操作按試劑盒說明書進行。

(3)骨密度的測定：末次給藥結束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組動物，四肢展開平置于雙能X 線吸收測量儀平臺上，通過計算機系統(tǒng)中小動物軟件測定右股骨部位骨密度(bone mineral density，BMD)。

(4)骨生物力學檢測：處死大鼠后取出完整股骨，將其右側股骨送至陸軍總院，用AG-IX生物力學萬能實驗機檢測最大載荷和斷裂載荷等相應指標。

(5)HE染色觀察骨形態(tài)學變化：動物處死后取完整股骨，對左側股骨脫鈣處理并脫蠟至水，蒸餾水2-5 min，蘇木精30 min，1%鹽酸乙醇20sec，自來水沖洗。1%伊紅復染后蒸餾水沖洗30sec。脫水、封片、鏡檢。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 一般狀態(tài)及體重結果

與假手術組比較，模型組及各干預組大鼠皮毛欠光滑，其他一般狀況(精神狀態(tài)、活動、飲食飲水、大小便)均未見明顯異常。與模型組對比，西藥對照組及藤黃健骨膠囊各干預組精神狀態(tài)、活動、飲食飲水、大小便均無差異。與假手術組比較，模型組及給藥組大鼠體重均明顯升高(P<0. 05)；與模型組比較，藤黃健骨膠囊高劑量組體重顯著降低(P<0. 05)；藤黃健骨膠囊低、中劑量組和西藥對照組體重較模型組降低，但無顯著差異。見表1。

表1 藤黃健骨膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠末次給藥后體重的影響Table 1 Effect of gamboge strong-bone capsule on the weight of ovariectomized rats after the last drug given

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.2 對骨代謝相關血清生化指標的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清BGP含量顯著降低，trACP含量顯著升高(P<0. 05)；與模型組比較，藤黃健骨膠囊各干預組和西藥對照組血清BGP含量含量均顯著升高，藤黃健骨膠囊高劑量組血清trACP含量明顯降低(P<0. 05)。見表 2。

表2 藤黃健骨膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠血清生化指標的影響Table 2 Effect of gamboge strong-bone capsule on the serum biochemical indices in ovariectomized rats

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.3 對骨密度的影響

與假手術組比較，模型組大鼠BMD顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，藤黃健骨膠囊各干預組和西藥對照組BMD均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 藤黃健骨膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠骨密度的影響Table 3 Effect of gamboge strong-bone capsule on bone mineral density in ovariectomized rats

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.4 對骨生物力學參數的影響

與假手術組比較，模型組大鼠股骨的結構力學參數如最大載荷、斷裂載荷等均明顯下降(P<0.05)；藤黃健骨膠囊各干預組和西藥對照組可明顯改善去卵巢大鼠斷裂載荷參數，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和西藥對照組可明顯改善去卵巢大鼠最大載荷參數(P<0.05)。見表4。

表4 藤黃健骨膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠骨生物力學的影響Table 4 Effect of gamboge strong-bone capsule on biomechanical properties of the femur in

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.5 股骨骨形態(tài)學影響

假手術組大鼠可見骨小梁排列規(guī)則、緊密、有序、結構完整、呈網狀，密度、面積正常，骨小梁間隙較??；模型組大鼠可見骨小梁排列不規(guī)則，數量減少，結構稀疏，骨小梁丟失、斷裂嚴重，骨小梁之間連接點較少，分布稀疏凌亂，間距增大；藤黃健骨膠囊高劑量組和西藥對照組大鼠骨小梁明顯增粗，排列尚整齊并連接成網，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大。見圖1。

圖1 股骨病理形態(tài)學變化(HE，100×)Fig.1 The pathomorphological changes of the femur (HE, 100×)

3 討論

大多數骨質疏松癥患者為絕經后女性，其特點是雌激素水平下降[5]。目前，骨質疏松的經典治療仍然選用激素替代療法，西藥戊酸雌二醇片是補充或替代雌激素分泌不足的一種處方藥，主要用于由自然或人工絕經導致的雌激素缺乏病，但長期使用雌激素易增加患者患乳腺癌、子宮出血、心血管系統(tǒng)疾病等疾病的風險[6]。而中藥治療骨質疏松，具有安全、毒副作用小等優(yōu)點[7]。

中醫(yī)將骨質疏松歸屬于“骨痿”“骨痹”等范疇。中醫(yī)認為，腎為先天之本，主骨生髓，腎精虧虛，骨髓生化無源，骨骼失養(yǎng)，發(fā)生骨折，認為腎虛是造成骨病的主要原因[8]，故治則以補腎為主。方中熟地黃滋補腎陰，骨碎補、肉蓯蓉和淫羊藿補腎助陽，鹿銜草和雞血藤補肝腎、強筋骨。諸藥合用，具有補腎，活血，止痛的功效。

骨代謝生化指標中的骨形成標志物和骨吸收標志物能夠動態(tài)地反映骨代謝情況。骨鈣素(BGP)主要由成骨細胞合成并分泌，在骨形成受到抑制時BGP會降低，是評價骨形成和骨轉換率的特異性指標[9]?？咕剖崴嵝粤姿崦?trACP)可由破骨細胞釋放后進入血循環(huán)，骨吸收活躍時trACP會升高，是反映骨吸收的特異性指標[10]。本實驗藤黃健骨膠囊各干預組和西藥對照組血清BGP含量較模型組均顯著升高，而藤黃健骨膠囊高劑量組血清StrACP 含量較模型組顯著降低，提示藤黃健骨膠囊可影響骨代謝，其機制是通過促進骨形成、增強骨轉化，抑制骨吸收實現(xiàn)的。

骨組織骨量、結構、形狀及內在的生物力學等指標對骨組織的強度起決定作用[11]。骨密度(BMD)可以反映骨質量和骨強度，是一種可預測骨折危險性的敏感指標[12]。本實驗藤黃健骨膠囊各干預組和西藥對照組BMD明顯增加，提示藤黃健骨膠囊可有效降低骨質疏松癥骨折的發(fā)生率，其機制可能是通過增加BMD實現(xiàn)的。骨生物力學主要是研究骨組織在外界作用下的力學性能和骨在受力后的所產生的生物學效應，是評價藥物對骨質量的指標[13]，骨量的減少以及骨質內部結構的改變均能影響骨生物力學，可降低生物力學強度。本實驗結果顯示，藤黃健骨膠囊各干預組和西藥對照組斷裂載荷參數較模型組明顯升高；與此同時，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和西藥對照組最大載荷參數較模型組也明顯升高，提示藤黃健骨膠囊通過改善骨生物力學的性能來防治骨質疏松。

骨的病理形態(tài)學觀察是反映骨質疏松的病理組織狀況的客觀指標[3]。摘除女性卵巢后，骨的重建會加快，骨質丟失嚴重，骨小梁變薄，連接性中斷、間隙變大，引發(fā)骨質疏松癥。本實驗結果顯示，藤黃健骨膠囊高劑量組和西藥對照組大鼠與模型組比較，骨小梁明顯增粗，排列尚整齊并連接成網，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大，說明藤黃健骨膠囊通過改善或修復骨組織的形態(tài)結構來防治骨質疏松。

總之，本實驗通過體內動物實驗證明了成年雌性SD大鼠卵巢切除后，BMD、BGP、最大載荷和斷裂載荷等指標均明顯降低，trACP含量明顯升高，使骨吸收大于骨形成，造成骨代謝失平衡，最終導致骨質疏松發(fā)生。而藤黃健骨膠囊具有類雌激素的作用，可以拮抗上述骨質疏松的相關指標來發(fā)揮保護骨組織的作用。該研究結果為藤黃健骨膠囊治療骨質疏松的機制提供了理論依據。