柴生颋 謝平金 萬雷 林勇

1. 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240 2. 廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心中醫(yī)骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見的骨疾病之一，它是以一種由于骨強度降低而使骨折風險升高的全身性骨骼疾病，目前已在世界常見病多發(fā)病中居第七位，成為世界性前沿研究難題。且隨著老齡化社會的到來，OP的發(fā)病率目前正以驚人的速度增長，防治骨質(zhì)疏松癥已成為當今國際上的研究熱點。本實驗，補腎健脾活血方含藥血清對UMR106細胞成骨分化和骨形成相關(guān)蛋白的影響，以期從細胞分子學角度探討補腎健脾活血方(骨康方)防治OP的作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及細胞

購置UMR106細胞(上海中科院)；4月齡 SD 雌性大鼠40只， 用于制備含藥血清。

1.2 實驗藥物

補腎健脾活血方(淫陽藿10 g、熟地黃10 g、肉蓯蓉10 g、大棗10 g、當歸10 g、 丹參10 g、菟絲子10 g、補骨脂10 g、黃芪10 g、白芍10 g)，并在本院制劑室常規(guī)水煎制，濃縮，生藥含量為1.43 g/mL。陽性對照藥：戊酸雌二醇片(補佳樂，J20130009)。

1.3 實驗試劑儀器及器械

UMR106細胞完全培養(yǎng)基配制：DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone，Cat. No.SH 30022.01B)+10%胎牛血清(Gibco，Cat. No.10099-141)+1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，4 ℃放置，37 ℃水浴溫浴后使用；CCK8檢測工作液配制：10 μL CCK8檢測原液+100 μL細胞完全培養(yǎng)基，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；青鏈霉素，PBS緩沖液，胰酶(GENVIEW，Cat.No.9002-07-7)，ALP測試盒南京建成(A059-1)Cell Counting Kit-8(Dojindo，Cat.No.CK04)；超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)；低速離心機(Anke/飛鴿TDL-80-2B)；倒置顯微鏡(MOTI)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Memmer，INC108)；酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Thermo Fisher Scientific，multiscan MK3)；ALP 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，A059-1)。上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品水平離心機 (上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品，TDL-80-2B)；普通培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產(chǎn)品，DHP-02.420)； HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市晨陽電子儀器廠，XMTD203)；Thermo酶標儀(MULTISKAN MK3)；pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司，02220128)；臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠，TDL-80-2B)；恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠，DYY-6C)；冷凍高速離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司，Hema TGL-16R)；氣一電流儀(JUNY1，JY300)；容聲柜式冰箱(青島海爾特種電器有限公司，BD/C310)；立式超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司，DW-86L486)；掃描儀(MICROTEK，Bio-5000)；AX-Ⅱ X射線攝影暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械， 127 mm×178 mm)；SDS-PAGE垂直電泳槽(北京凱元伯樂生物科技有限公司，MP-8001)；漩渦振蕩器(上海精科實業(yè)有限公司，XW-80 A)；超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，JY 92-IIN)；多用脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，XK-8)；磁力攪拌器(常州國華電器有限公司，78)；Tris-base、Glycine、 SDS(十二烷基硫酸鈉)(上海生工，TB0194-2.5KG/GB0235-2.5KG/SB0485-500G)；PVDF膜(Millipore，IPVH00010)；醫(yī)用X-光片(廣西巨星醫(yī)療器械有限公司，SUPER RX-N-C 5×7)；Acrylamide(丙烯酰胺)、BIS-Acrylamide(雙丙烯酰胺)(Genview，GA006-500G/GN199-25G)；Ammonium persulphate(過硫酸銨)(GENVIEW，GA019-50G)；蛋白定量試劑盒(Thermo，23227)；裂解液(碧云天，P0013)；DTT(二硫代蘇糖醇)碧云天(ST040)；PMSF(苯甲基磺酰氟)、溴汾藍(Genebase，329-98-6/ 115-39-9)。

1.4 含藥血清的制備

將4月齡 SD 雌性大鼠40只，隨機分成 5 組、每組 8只。低劑量組按2.4 g生藥 /kg 大鼠體重灌胃，中劑量組按4.8 g生藥 /kg 大鼠體重灌胃，高劑量組按9.6 g生藥 /kg；陽性對照組每只大鼠灌胃大約戊酸雌二醇片0.1 g/ kg(用生理鹽水溶至1 mL)；空白血清組每只大鼠灌胃生理鹽水大約20 mL/ kg。每天2次， 間隔5 h，，連續(xù)6天。第7天進行腹主動脈取血，并分離血清，過濾后分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 UMR106細胞的培養(yǎng)

①UMR106 細胞體外培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(4 ℃放置，37 ℃水浴溫浴后使用)，取出長至80%的UMR106細胞，吸掉舊培養(yǎng)液；用PBS洗滌細胞一至二次；加入胰酶溶液，輕洗細胞皿底部，吸掉胰酶溶液，放入37 ℃培養(yǎng)箱2～3 min，于倒置顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，加入新鮮完全培養(yǎng)基，使用移液器將細胞吹勻，制備單細胞懸液；②計數(shù)，并將細胞密度調(diào)整為1×105/mL；取出96孔板，接種100 μL密度為1×105/mL的細胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，次日，按：正常大鼠血清組；低劑量含藥血清組；中劑量含藥血清組；高劑量含藥血清組；陽性對照組；分組進行加藥，分別培養(yǎng)72 h。③細胞處理結(jié)束的前4 h，吸去培養(yǎng)液，按每100 μL完全培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8將二者混合均勻后，每孔加入100 μL的CCK-8混合液，避免產(chǎn)生氣泡，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，4h后，將96孔板中的培養(yǎng)基移至酶標板中，酶標儀檢測450 nm處的OD殖。

1.6 ALP 活性的測定

ALP 活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)A059-1)檢測各組細胞培養(yǎng)72 h后的ALP 活性，酶標儀上測定各孔A520 nm殖。并計算血清中ALP活力。

計算公式：

血清中AKP活力(金氏單位/100ml)=

1.7 OPN、RUNX2、BMP-2蛋白檢測

各組經(jīng)血清分別培養(yǎng)72 h后，按比例加入裂解液，充分裂解后，120 000 g離心2～5 min，取上清液。提取總蛋白，測定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e至于濃縮膠和分離膠中電泳，350mA轉(zhuǎn)膜70 min。37封閉液中封閉1 h；將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的OPN(稀釋比例1∶8000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜35 min，廠家：Abcam，貨號：ab91655)抗體、RUNX2(稀釋比例1∶1000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，廠家：Abcam，貨號：ab23981)抗體、BMP-2(稀釋比例1∶4000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，廠家：Abcam，貨號：ab183729)抗體，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min；將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi)，置于搖床上室溫平緩搖動40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家：BOSTER，貨號：BA1054，稀釋比例：1∶20000，孵育條件：室溫孵育40 min)25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min；用化學發(fā)光顯色后進行圖像分析，經(jīng)軟件分析，以OPN/GAPDH、RUNX2/GAPDHBMP-2/GAPDH比值表示OPN、RUNX2、BMP-2蛋白表達水平

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清對UMR106細胞ALP活性的影響

如表1所示，與空白血清組比較，中劑量血清組、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預72 h后，細胞吸光度值均較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與空白血清組比較，低、中、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預72 h后，細胞ALP活性均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著中藥血清水平升高，ALP活性越高。

表1 各組血清對UMR106細胞增殖和ALP活性的影響Table 1 Effect of the serum on the cell proliferation and ALP activity in UMR106 cells of each group

注: 與空白血清組比較，*P<0. 05

2.2 各組UMR106細胞中的OPN、RUNX2、BMP-2蛋白水平

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見的骨疾病之一，它是以一種由于骨強度降低而使骨折風險升高的全身性骨骼疾病。由于骨質(zhì)疏松時骨強度下降，在生活中輕微外力作用下即可造成骨折，骨折作為OP最嚴重的并發(fā)癥和早期死亡的危險因素之一[1]，給患者及社會帶來沉重負擔。

圖1 各組UMR106細胞中的OPN、RUNX2、BMP-2蛋白水平注: 與空白血清組比較，*P<0. 05Fig.1 The protein concentrations of OPN, RUNX2, and BMP-2 in UMR106 cells of each group

圖2 各組UMR106細胞中OPN、RUNX2、BMP-2表達凝膠電泳圖Fig.2 The expression of OPN, RUNX2, and BMP-2 in UMR106 cells in each group

中醫(yī)認為OP屬于“骨痿”范疇，其病位在腎，發(fā)病關(guān)鍵是“腎虛”。隨著年齡增長，腎中精氣由充盛轉(zhuǎn)而逐漸衰敗，性腺功能亦隨之漸漸衰退。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合臨床體會，我們認為腎虛是OP的主要病因，并由此篩選補骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子、黃芪等中藥組成了治療骨質(zhì)疏松癥的補腎健脾活血方(骨康方)。成骨細胞作為參與骨生成、生長、吸收及代謝的關(guān)鍵細胞，具有活躍的分泌功能，能合成和分泌骨基質(zhì)中的多種有機成分，對骨生長有重要作用；此外，細胞表面存在多種骨吸收刺激因子的受體，細胞并能分泌一些細胞因子，調(diào)節(jié)骨組織形成和吸收。因此，鑒定新的重要的成骨細胞生長調(diào)節(jié)因子，深入研究骨發(fā)育和骨重塑的分子機制，就顯得非常必要。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎健脾活血方(骨康方)可以增加PMOP患者骨密度[2]，且其含藥血清對成骨細胞和破骨細胞均有影響，可改變細胞生存環(huán)境中OPG/ RANKL的比例，間接影響著破骨細胞的功能活性[3]。

本實驗采用的大鼠類成骨細胞UMR106，保留了成骨細胞形態(tài)和性質(zhì)上獨有的特征，具有穩(wěn)定、均一、純度高、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于代替成骨細胞的細胞系，并用于研究各種調(diào)控骨質(zhì)疏松的激素、生長因子在細胞水平上治療骨質(zhì)疏松的作用機制[4-6]。故本實驗選取UMR106作為代替成骨細胞，以研究補腎健脾活血方(骨康方)，在促進成骨分化中的作用。堿性磷酸酶作為成骨細胞分化早期分泌和高表達的標志酶，具有一定的特異性標志[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白血清組比較，低、中、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預72 h后，細胞吸光度值均較低(P<0.05), 而隨著含藥血清水平的增加，對UMR 106細胞增殖的促進作用相對減弱；與空白血清組比較，低、中、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預72 h后，細胞ALP活性均較高(P<0.05)，且隨著中藥血清水平升高，ALP活性越高。這充分說明骨康含藥血清對能明顯提高UMR 106的成骨分化，且劑量水平越高，ALP活性越高。

OPN是一種分泌型的糖基化磷酸化蛋白，分子結(jié)構(gòu)較特殊，富含精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，包含大量高度保守功能序列，作為成骨細胞成熟和分化過程的標志性因子在細胞黏附和基質(zhì)礦化中發(fā)揮著重要作用[8]。RUNX2 作為成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和成骨細胞分化的關(guān)鍵因子，不僅能調(diào)節(jié)成骨細胞的分化，還可調(diào)節(jié)成骨細胞的成熟，在胚胎發(fā)育過程中，RUNX2 的表達是成骨細胞分化的開始，RUNX2 的缺失將導致骨發(fā)育不良或終止[9-10]。亦有研究[11]表明，BMP-2能夠促進成骨細胞的增殖和分化，具有高效的誘導成骨活性。本實驗結(jié)果中，經(jīng)補腎健脾活血方(骨康方)含藥血清培養(yǎng)后UMR106細胞OPN、RUNX2、BMP-2均顯著上調(diào)，且呈濃度梯度性變化，各中藥含藥血清組以高劑量組表達最為明顯，這表明補腎健脾活血方(骨康方)能夠通過上調(diào)OPN、RUNX2、BMP-2從而促進UMR106細胞成骨分化。

綜上所述，補腎健脾活血方(骨康方)含藥血清對成骨樣細胞UMR106成骨分化具有促進作用，并能上調(diào)OPN、RUNX2、BMP2等相關(guān)骨形成蛋白的表達。但OPN、RUNX2、BMP2因子表達上調(diào)后能否進一步激活成骨細胞特異性的下游靶基因、實現(xiàn)的具體途徑如何，還有待進一步的研究。細胞的調(diào)節(jié)作用表明其具有被開發(fā)為抗骨質(zhì)疏松藥物的潛力，下一階段將重點研究補腎健脾活血方(骨康方)含藥血清調(diào)節(jié)成骨樣細胞UMR106的分子機制，為補腎健脾活血方在防治OP方面，提供新的科學依據(jù)和實驗方法。