鐘恬田， 黎博宇， 趙建國(guó)， 楊雨輝， 蘭堅(jiān)強(qiáng)， 龔幫俊， 韓 謙

(海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院， 海南 海口 570228)

多殺菌素(Spinosad)是20世紀(jì)90年代初期開(kāi)發(fā)的一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是由土壤中的放線菌刺糖多孢菌(SaccharopoLysporaspinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。相比其他殺蟲(chóng)藥物，多殺菌素有著獨(dú)特的作用機(jī)制，主要是通過(guò)作用于煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)，極大地延長(zhǎng)乙酰膽堿(Ach)的作用時(shí)間[2-3]。多殺菌素具有高效低毒、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，介于以上這些優(yōu)點(diǎn)，該藥于1999年贏得“美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的人飼養(yǎng)寵物，研究發(fā)現(xiàn)多殺菌素對(duì)貓、狗、羊、牛等家畜的蚤類、蜱、虱子等體外寄生蟲(chóng)有較好的防制作用，多殺菌素的用途越來(lái)越廣泛[5]。但該藥難溶于水，口服吸收差，有較大的首過(guò)效應(yīng)，且體內(nèi)的半衰期短，這些性質(zhì)嚴(yán)重削弱了多殺菌素口服制劑藥效的發(fā)揮。多殺菌素微乳液具有熱力學(xué)穩(wěn)定性，可進(jìn)行熱壓滅菌，其黏度較低，注射時(shí)刺激性小，且可以解決其難溶性的問(wèn)題，藥物從乳劑的油相中緩慢釋放，可以適當(dāng)延長(zhǎng)持效期、減少用藥量且降低給藥次數(shù)，大大地提高生物利用度和藥效[6]。

本試驗(yàn)分別采用了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)兩種檢測(cè)方法探索家兔皮下注射多殺菌素微乳注射劑后兔血液中藥物的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為臨床應(yīng)用該新劑型治療相關(guān)疾病提供部分參考理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津公司LC-20AD)；氮?dú)獯祾邇x(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司UGC-45)；超聲波清洗機(jī)(深圳市超藝達(dá)科技有限公司PS-40)；高速離心機(jī)(Eppendorf AG 22331)；磁力攪拌器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司GL-3250A)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司ME204E)；超低溫冰箱(海爾BD-226W)；微型漩渦儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司XW-80A)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司Elx808)；洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限公司DEM-3)。

1.2 藥品及試劑 多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院宋淵教授提供)；油酸乙酯(山東西亞化學(xué)股份有限公司)；吐溫80(麥克林)；丙二醇(廣州化學(xué)試劑)；甲醇(美國(guó)Tedia公司)；乙腈(美國(guó)Tedia公司)；乙酸乙酯(廣州省化學(xué)試劑工程技術(shù)公司)；異戊醇(廣州化學(xué)試劑)；肝素鈉(生工生物工程有限公司)；酒精；超純水；0.22 μm微孔濾膜。

1.3 動(dòng)物 健康新西蘭兔6只，體重1.8-3.7 kg，雌雄各半，購(gòu)自某新西蘭兔養(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)于海南大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)室。試驗(yàn)前自飼養(yǎng)2周，且未服用任何可能影響本品代謝吸收的藥物，血液生化指標(biāo)檢查均正常。采樣期間正常飼養(yǎng)，不限制飲水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 多殺菌素的微乳制備 多殺菌素自乳化的處方含1%多殺菌素原藥，由海南大學(xué)熱帶動(dòng)物醫(yī)學(xué)與病媒介生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制。該劑型為澄清透明的液體，微帶淡藍(lán)色乳光，流動(dòng)相較好，該處方所選用的輔料均無(wú)毒性。該制劑顯著提高了多殺菌素在水中的的溶解度，將其制成自乳化制劑后，一方面不僅可以提高藥物溶解度，而且制劑在體內(nèi)可自發(fā)形成0/W型微乳液，促進(jìn)藥物吸收，且大大拓寬了該藥的給藥途徑。

2.2 給藥方法和血樣采集 兔子分別編號(hào)為1～6號(hào)，所有兔子均按照0.25 mg/kg·bw劑量，皮下注射給藥，并在給藥前0.5 h由耳緣靜脈采集空白血樣5 mL，在給藥后的0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0，48.0，96.0，144,192，240,336 h采集血樣1 mL。1、3、5號(hào)兔血采集后迅速置于含肝素抗凝的離心管中，3 500 r/min離心10 min，吸取上層血漿轉(zhuǎn)入另一離心管中，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存；2、4、6號(hào)兔血采集后置于空離心管中，37 ℃下放置2 h，將析出的血清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。整個(gè)試驗(yàn)期間，嚴(yán)密觀察兔子的精神狀態(tài)和臨床反應(yīng)，包括食欲，飲水狀況，大小便和可能出現(xiàn)的胃腸道等方面的不良反應(yīng)。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法測(cè)定血清中藥物濃度 向96孔板中加入200 μL由包被緩沖液稀釋的多殺菌素包被原(多殺菌素-OVA)，并于37 ℃ 孵育3 h。使用PBST溶液洗板3次后，每孔加入200 μL脫脂牛奶封閉0.5 h。洗板后每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，隨后加入100 μL mAb，于37 ℃ 競(jìng)爭(zhēng)1 h。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)束后棄反應(yīng)液，洗板3次，每孔加入200 μL的PBSTG稀釋的羊抗鼠二抗(IgG-HRP)溶液，于37 ℃孵育0.5 h。洗板后每孔加入200 μL TMB底物顯色液，室溫孵育15～20 min，加入100 μL終止液(2 mol/L H2SO4)，用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度。

2.4 高效液相色譜法測(cè)定血漿中藥物濃度

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水(49∶49∶2)，使用前經(jīng)超聲混勻備用；體積流量：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 精密稱取多殺菌素0.01 g 標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用甲醇逐級(jí)稀釋為400，200，100，50，25，12.5 ng/mL的梯度濃度溶液，經(jīng)HPLC檢測(cè)，用峰面積A對(duì)濃度c(ng/mL)作線性回歸，結(jié)果表明，多殺菌素在12.5～400 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好(R=0.9999)。

2.4.3 血漿樣品前處理方法篩選 吸取適量的兔空白血漿，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)液，配制為終濃度為0.025 mg/mL的血漿樣品1 mL，分別經(jīng)加入樣品量4倍、3倍、3倍的甲醇、乙腈、乙酸乙酯，漩渦10 min后，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一試管中，于40℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)鼜?fù)溶于1 mL乙腈中，過(guò)濾膜后經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)濃度，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)后，測(cè)出峰面積并計(jì)算其萃取回收率。萃取回收率=(血漿中藥物的峰面積/對(duì)應(yīng)濃度非血漿中的藥物的峰面積)×100% 最終選擇乙腈蛋白沉淀法作為前處理方法，平均萃取回收率可達(dá)86.77%，提取方法可靠。實(shí)際測(cè)量未知濃度血漿時(shí)，應(yīng)盡可能通過(guò)氮?dú)獯祾叩姆椒?，使樣品濃縮，從而減小誤差。

2.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 將1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用空白血漿稀釋配置成0.025、0.2、0.8 mg/mL這3個(gè)濃度的待測(cè)樣，經(jīng)2.4項(xiàng)操作后計(jì)算回收率和日內(nèi)、日間精密度，每種溶液3個(gè)重復(fù)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品的濃度，將求得濃度與已知加入濃度相比，回收率=(所算濃度/已知濃度)×100%。其回收率分別為94.5%，表明該方法回收率符合要求；其日內(nèi)和日間的精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為1.06%，1.57%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)條件下所用方法的精密度符合要求,測(cè)定方法可靠。

2.5 數(shù)據(jù)分析處理 采用基于 ExceL 的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)分析程序-PKsoLver 1.0的非房室模型來(lái)處理藥動(dòng)數(shù)據(jù)，分別計(jì)算出每只新西蘭兔的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，然后計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤，并對(duì)兩種分析方法下的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，同時(shí)以血藥濃度平均值對(duì)時(shí)間作藥-時(shí)曲線。

3 結(jié)果

血藥濃度曲線和藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 6只家兔單次皮下注射多殺菌素微乳劑后分別經(jīng)高效液相色譜方法和ELISA方法檢測(cè)下不同時(shí)間下的血藥濃度曲線見(jiàn)圖1，將藥-時(shí)數(shù)據(jù)輸入藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件PKsolver,采用非房室模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)[7]。其中Cmax 和Tmax為實(shí)測(cè)值，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 新西蘭兔皮下注射多殺菌素注射液(0.25 mg/kg·bw)后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) (n=6)

圖1 分離菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

4 討論

4.1 檢測(cè)方法的建立 本試驗(yàn)中采用了兩種方法檢測(cè)家兔血液中多殺菌素的含量。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)后，首先建立了檢測(cè)血漿中多殺菌素的提取方法，通過(guò)對(duì)常用樣品前處理方法：蛋白沉淀法，液液萃取法的比較篩選，最終選擇乙腈作為蛋白沉淀劑對(duì)血漿進(jìn)行處理。其次建立了多殺菌素含量的檢測(cè)方法，所用的多殺菌素液相檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線R大于0.99,日內(nèi)與日間變異系數(shù)RSD值小于9%,血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾多殺菌素的測(cè)定,實(shí)現(xiàn)了主峰與雜質(zhì)峰的良好分離，滿足藥動(dòng)學(xué)測(cè)定的要求。同時(shí)，通過(guò)制備多殺菌素單克隆抗體，從而通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)的方法檢測(cè)血清中的多殺菌素含量，該檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線R大于0.99，加標(biāo)曲線回收率可達(dá)到穩(wěn)定在90%以上，同樣可滿足藥動(dòng)學(xué)測(cè)定的要求。其中，ELISA分析方法操作方便、靈敏、檢測(cè)限低、而液相方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，但需要通過(guò)前處理方法將待測(cè)樣品提純后再進(jìn)行檢測(cè)。

4.2 藥動(dòng)學(xué)特征 液相色譜法及酶聯(lián)免疫法檢測(cè)藥物濃度的半衰期、達(dá)峰時(shí)間，藥時(shí)曲線下面積、平均滯留時(shí)間等主要藥代動(dòng)力參數(shù)均無(wú)顯著差異，通過(guò)兩種方法對(duì)血液樣品的檢測(cè)，可知多殺菌素在 2～4 h達(dá)到最大血藥濃度，而后快速降低，而多殺菌素原藥在口服給藥后的2～8 h到達(dá)峰濃度，兩者相比較，微乳注射劑起效更快，可作為動(dòng)物急性疾病的治療方案。在家兔體內(nèi)的藥代參數(shù)值與在狗體內(nèi)的相比，動(dòng)物體內(nèi)代謝可見(jiàn)相似的趨勢(shì)特征，但仍存在一定的種屬差異，主要表現(xiàn)在藥物半衰期在兔體內(nèi)時(shí)間略短于在狗體內(nèi)[8]，這可能跟動(dòng)物胃部pH值存在一定的聯(lián)系，該制劑在新西蘭兔體內(nèi)分布廣泛，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。本試驗(yàn)中家兔按0.25 mg/kg·bw， 一次皮下注射后，30 min后血漿中多殺菌素即可達(dá)到187.13 ng/mL,60、90 min分別達(dá)到228.47、318.95 ng/mL，至48，96 h之后血漿中藥物濃度維持在 94.98、71.28 ng/mL。在該制劑的藥效預(yù)試驗(yàn)中可證明該給藥劑量可對(duì)多種體內(nèi)外寄生蟲(chóng),比如虱子、螨蟲(chóng)、腸道線蟲(chóng)等起到有效的防制作用。

4.3 制劑特點(diǎn) 微乳作為一種新型的給藥系統(tǒng)，大大增加了多殺菌素的溶解性，降低了在給藥過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的刺激性和毒性。同時(shí)，微乳具有不良反應(yīng)小，容易被機(jī)體代謝，可供注射使用的優(yōu)點(diǎn)。多殺菌素微乳注射劑質(zhì)地較稀，黏度不高，在注射劑過(guò)程中易于抽取和推注，具有較好的實(shí)用優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。