張千振， 葛延松， 焦智慧， 李 輝， 白 鴿， 張建濤， 王洪斌

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

缺血再灌注損傷(IRI)是一種多因素參與的病理生理過程。肝臟是血供豐富和存在大量內(nèi)皮細(xì)胞的器官，因此肝臟對缺血再灌注損傷非常敏感。肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)是肝臟術(shù)后肝功能衰竭的重要因素之一，它多見于肝臟外科手術(shù)過程中，如肝部分切除術(shù)及肝移植術(shù)等[1]。研究表明，肝臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡[2]。細(xì)胞凋亡是由特定的凋亡基因調(diào)控的程序性死亡，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和機(jī)體發(fā)育中至關(guān)重要[3]。腹腔鏡技術(shù)具有切口小、損傷輕、恢復(fù)快的特點(diǎn)，并且成功應(yīng)用于肝臟外科手術(shù)中。目前腹腔鏡肝切除手術(shù)過程中缺血再灌注損傷對細(xì)胞凋亡的影響迄今未見報(bào)道，本研究應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)建立小型豬肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷模型，并檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9酶活性，分析小型豬腹腔鏡肝損傷與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為探討缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制和保護(hù)性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 廣西巴馬小型豬12頭，4～6月齡，體重25～35 kg，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和臨床檢查健康，整個(gè)試驗(yàn)過程中飼養(yǎng)管理環(huán)境一致。

1.2 主要設(shè)備與試劑 腹腔鏡手術(shù)基本設(shè)備，Olympus 公司生產(chǎn)；左彎分離鉗、直角分離鉛、無損傷腸鉗、彎頭剪刀、單極電凝球、單極電凝鉤、沖洗/吸引管，杭州光典公司生產(chǎn)；IntelliiVue MP30型重癥監(jiān)護(hù)儀，德國Philips公司生產(chǎn)；小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)外科教研室配制；丙泊酚注射液，西安力邦制藥有限公司，批號(hào)1404271；硫酸阿托品注射液，新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)1605047 2；酚磺乙胺注射液，新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)1605297 3；TRIZol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自東洋紡；引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Caspase-3和Caspase-9活性檢測試劑盒，均為碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；TUNEL凋亡檢測試劑盒，購自美國羅氏公司。

1.3 手術(shù)方法 將12頭巴馬小型豬隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)和模型組(IRI組)。假手術(shù)組僅建立氣腹60 min，模型組進(jìn)行腹腔鏡右半肝缺血60 min+左半肝切除。術(shù)前禁食24 h，禁水12 h。麻醉前肌肉注射硫酸阿托品注射液(0.04 mg/kg·bw)，15 min后耳緣靜脈注射小型豬復(fù)合麻醉劑(0.02 mL/kg·bw)、丙泊酚注射液(0.5 mL/kg·bw)進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。完成氣管插管后，連接呼吸麻醉機(jī)，呼吸頻率為15～20次/min，吸呼比為1∶2，潮氣量為10～15 mL/kg·bw，異氟烷維持麻醉，濃度維持在2.5%～4%。小型豬仰臥保定，術(shù)部剃毛、消毒、鋪蓋創(chuàng)巾。

腹腔鏡右半肝缺血60 min+左半肝切除組(I/R組)：采用四套管法建立氣腹和手術(shù)通路，通入CO2維持氣腹壓在10 mmHg。在腹腔鏡視野下切斷肝圓韌帶、鐮狀韌帶、左右三角韌帶及冠狀韌帶，充分游離肝葉。首先助手用腸鉗將右肝內(nèi)葉提起，術(shù)者利用左彎分離鉗和直分離鉗將膽囊管和膽囊動(dòng)脈與肝實(shí)質(zhì)充分分離，同時(shí)將自制止血帶從膽囊管和膽囊動(dòng)脈底部穿過，穿過右內(nèi)葉基部；另一根止血帶同樣穿過右外葉基部，同時(shí)收緊兩條止血帶，持續(xù)阻斷右半肝入肝血流60 min。缺血結(jié)束后，松開卡扣，撤出兩條止血帶，恢復(fù)右半肝血供，同時(shí)進(jìn)行左半肝切除。在左內(nèi)葉與右內(nèi)葉分界線(肝中裂)用帶線雙針三排貫穿結(jié)扎肝實(shí)質(zhì)，每排3～4針。用電凝球在結(jié)扎線左側(cè)1～2 cm處做一預(yù)切線，并用電凝鉤在預(yù)切線處離斷肝實(shí)質(zhì)，將左內(nèi)葉和左外葉全部切除。檢查斷面有無出血點(diǎn)，利用電凝球和紗布止血，用沖洗器沖洗腹腔。將自封袋送入腹腔，切除的肝組織及止血帶和卡扣裝入袋內(nèi)，擴(kuò)大套管腹壁切口至4 cm左右，將自封袋從腹腔取出，關(guān)閉氣腹。在腹底部套管放置1根引流管，并在體外固定，按常規(guī)手術(shù)操作閉合腹腔，切口周圍涂碘酊消毒。

1.4 樣本采集及指標(biāo)檢測

1.4.1 樣本采集及處理 各組分別于術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后1、3、7 d采集肝組織樣本，將肝組織分成2份：一份肝組織分裝置于凍存管并放入液氮中保存；另1份肝組織置于多聚甲醛固定液中固定，然后行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋等處理。

1.4.2 酶活性檢測 根據(jù)Caspase-3、9活性檢測試劑盒說明書，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各組織樣本的OD值(405nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本Caspase-3、Caspase-9酶活性。

1.4.3 qRT-PCR檢測Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá) TRIZol法提取肝組織總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。Bax、Bcl-2及β-actin 引物根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)，Bax引物序列：上游引物：5′-TTCAGGGTTTCATCCAGGATCG-3′，下游引物：5′-ATCCTCTGCAGCTCCATGTTAC-3′；Bcl-2引物序列：上游引物：5′-GAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3′，下游引物：5′-GCCGGTTCAGGTACTCAGTC-3′；β-actin引物序列：上游引物：5′-TCTGGCAACCACACCTTCT-3′，下游引物：5′-TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3′。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 s；擴(kuò)增95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.4.4 肝細(xì)胞凋亡的檢測 各時(shí)間點(diǎn)采集肝組織并置于10%多聚甲醛固定液中，24 h后石蠟包埋并切片，按標(biāo)準(zhǔn)操作脫蠟和再水化組織。采用微波照射進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗2次后，將TUNEL反應(yīng)混合液滴加在樣品上，置于濕盒中避光孵育60 min(37 ℃)。PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的POD，濕盒中避光孵育30 min(37 ℃)。PBS沖洗3次，加入DAB顯色，蘇木素復(fù)染后封片。光學(xué)顯微鏡觀察(400倍)顯示細(xì)胞核為棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片選擇5個(gè)視野觀察凋亡情況，并計(jì)算出肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。肝細(xì)胞凋亡指數(shù)計(jì)算公式：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/肝細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色結(jié)果 組間比較，兩組AI在術(shù)后即刻差異顯著(P<0.01或P<0.05)，術(shù)后1 d、3 d差異極顯著(P<0.01)。兩組術(shù)后AI均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。假手術(shù)組在術(shù)后即刻與術(shù)前相比差異顯著(P<0.01或P<0.05)，術(shù)后1 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)。模型組在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、3 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，在術(shù)后1 d達(dá)到峰值，見封二彩版圖1及表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組肝細(xì)胞AI的變化

注：與術(shù)前相比，*表示差異顯著(P<0.01或P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；模型組與假手術(shù)組相比，#表示差異顯著(P<0.01或P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)，下表同

2.2 肝組織Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的變化

2.2.1 Bax mRNA表達(dá)水平 組間比較，兩組Bax mRNA表達(dá)在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、3 d差異極顯著(P<0.01)。兩組術(shù)后Bax mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。假手術(shù)組在術(shù)后即刻與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)。模型組在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、3 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，在術(shù)后1 d達(dá)到峰值，見表2。

2.2.2 Bcl-2mRNA表達(dá)水平 組間比較，兩組Bcl-2 mRNA表達(dá)在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、3 d差異極顯著(P<0.01)。假手術(shù)組在術(shù)后即刻與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)。模型組Bcl-2 mRNA 表達(dá)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，在術(shù)后即刻達(dá)到最低值，見表2。

2.2.3 Bax/Bcl-2比值 組間比較，兩組Bax/Bcl-2比值在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、3 d差異極顯著(P<0.01)。假手術(shù)組在術(shù)后1 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)。模型組Bax/Bcl-2比值表達(dá)水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、3 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，在術(shù)后1 d達(dá)到峰值，見表2。

BaxBcl-2Bax/Bcl-2假手術(shù)組模型組假手術(shù)組模型組假手術(shù)組模型組術(shù)前1.01.01.01.01.01.0術(shù)后即刻1.13±0.152.09±0.36??##1.28±0.20??0.60±0.15??##0.91±0.233.61±0.53??##1d1.38±0.22??3.10±0.55??##1.02±0.150.65±0.11??##1.39±0.31??4.77±0.77??##3d1.17±0.181.82±0.18??##1.17±0.150.86±0.16##1.02±0.242.22±0.57??##7d0.94±0.241.01±0.211.09±0.100.91±0.210.87±0.241.15±0.28

2.3 肝組織Caspase-3、Caspase-9活性變化

2.3.1 Caspase-9活性 組間比較，兩組Caspase-9活性在術(shù)后即刻、1 d、3 d差異極顯著(P<0.01)。兩組術(shù)后Caspase-9活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。假手術(shù)組在術(shù)后1 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P>0.05)。模型組在術(shù)后即刻、術(shù)后1 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，在術(shù)后1 d達(dá)到峰值。見表3。

2.3.2 Caspase-3活性 組間比較，兩組Caspase-3活性在術(shù)后1 d、3 d差異極顯著(P<0.01)。兩組術(shù)后Caspase-3活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。假手術(shù)組在術(shù)后1 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P>0.05)。模型組在術(shù)后即刻與術(shù)前相比差異顯著(P<0.01或P<0.05)，術(shù)后1 d、3 d與術(shù)前相比差異極顯著(P<0.01)，在術(shù)后1 d達(dá)到峰值，見表3。

Caspase-9(U/mg)Caspase-3(U/mg)假手術(shù)組模型組假手術(shù)組模型組術(shù)前6.22±1.236.79±0.835.25±1.144.32±0.15術(shù)后即刻7.23±1.7710.28±1.49??##5.69±1.176.80±0.97?1d8.66±1.21??17.39±2.82??##7.53±1.23??16.30±3.54??##3d6.36±0.798.47±1.27##5.87±1.429.62±1.22??##7d6.15±1.046.90±1.304.30±1.105.08±1.24

3 討論

自1991年Reich等[4]報(bào)道了腹腔鏡肝良性腫瘤切除以來，腹腔鏡技術(shù)在肝臟外科領(lǐng)域的應(yīng)用迅速發(fā)展。目前應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)可完成半肝切除術(shù)、擴(kuò)大半肝切除術(shù)、巨大腫瘤切除術(shù)及活體肝移植供肝切除術(shù)等[5]。肝臟是血供比較豐富的器官，肝臟手術(shù)過程中出血的控制非常關(guān)鍵。Pringle法對于入肝血流阻斷最為常見，止血效果好、操作簡單，但是此法容易導(dǎo)致缺血再灌注損傷[6]。近年來研究表明，組織、器官缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，認(rèn)為細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[7-9]。

本研究中通過TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)模型組凋亡細(xì)胞明顯高于假手術(shù)組，證實(shí)了小型豬腹腔鏡肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究表明，細(xì)胞凋亡主要通過受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑發(fā)生，后者受線粒體膜通透性的調(diào)控[10]。Bcl-2基因家族包括促凋亡因子(Bax，Bak，Bid)和抗凋亡因子(Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-w)，在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要的作用。Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡基因，具有頡頏Bcl-2的作用，Bax與Bcl-2的比值決定細(xì)胞受刺激后是否發(fā)生凋亡[11]。當(dāng)Bax相對表達(dá)量高于Bcl-2時(shí)，Bax可通過改變線粒體膜通透性促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞漿中，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并活化Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組術(shù)后即刻、1 d、3 d Bax mRNA表達(dá)水平較術(shù)前顯著升高，在術(shù)后1 d達(dá)到峰值，且顯著高于假手術(shù)組；模型組術(shù)后即刻、1 d Bcl-2 mRNA表達(dá)水平較術(shù)前顯著降低，且顯著低于假手術(shù)組。宋曉靜[13]等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟缺血60 min，恢復(fù)血液供應(yīng)2 h后Bcl-2 mRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著降低，Bax mRNA水平較假手術(shù)組顯著升高。Jin[14]等將大鼠肝臟血流阻斷30 min后，檢測再灌注1 h，2 h，6 h，24 h Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)再灌注后Bcl-2 mRNA表達(dá)隨著再灌注時(shí)間的延長逐漸降低，Bax mRNA表達(dá)隨著再灌注時(shí)間的延長逐漸升高。結(jié)合本研究結(jié)果，提示Bax和Bcl-2參與小型豬腹腔鏡肝損傷中肝細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

Caspase家族通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，包括凋亡啟動(dòng)子(Caspase-2、8、9)和凋亡執(zhí)行因子(Caspase-3、6、7)。凋亡啟動(dòng)子處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，活化后進(jìn)一步激活下游的凋亡執(zhí)行因子，通過作用于特異性底物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。Dirk等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟缺血60 min再灌注4 h后，Caspase-3活性較假手術(shù)組相比明顯升高。有文獻(xiàn)報(bào)道，在大鼠肝臟缺血60 min再灌注8 h后Caspase-9、Caspase-3mRNA和蛋白水平明顯升高，提示Caspase-9和Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，小型豬肝損傷后，肝組織中Caspase-9、Caspase-3活性顯著高于假手術(shù)組，模型組Caspase-9活性極顯著升高的時(shí)間點(diǎn)要早于Caspase-3，提示肝損傷后Caspase-9首先被活化，然后激活Caspase-3，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。因此，小型豬腹腔鏡肝損傷模型可能通過Caspases依賴途經(jīng)介導(dǎo)了肝細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

小型豬腹腔鏡肝臟缺血再灌注合并肝部分切除損傷可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與Bax轉(zhuǎn)錄水平升高，Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平降低，Caspase-3和Caspase-9活性增強(qiáng)有關(guān)。