徐麗紅，周 鑫，鄭蔚然，黎天天，何中方，詹福云，白麗萍，王君虹

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 2.樂(lè)清市中方潤(rùn)石斛有限公司，浙江 樂(lè)清 325600；3.樂(lè)清市雁蕩山飛渡鐵皮石斛研究所，浙江 樂(lè)清 325600)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)屬蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，具有滋陰清熱、益胃生津、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等功效，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱等病癥[1-2]。近年來(lái)對(duì)鐵皮石斛莖化學(xué)成分的研究已取得較大進(jìn)展，有文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛中存在酚類及黃酮類化合物，多酚、黃酮是重要的抗氧化活性成分[3-5]。雖然鐵皮石斛黃酮含量較低，但是黃酮類化合物是生物堿的一種，具有降血脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多種生理活性，對(duì)于探究鐵皮石斛的藥用價(jià)值具有一定的參考作用[6-7]。由于鐵皮石斛生長(zhǎng)條件十分苛刻，自然產(chǎn)量極為稀少，更因民間長(zhǎng)期過(guò)度采挖，致使野生資源瀕臨絕種[8]。國(guó)內(nèi)從20世紀(jì)70年代開始規(guī)模化鐵皮石斛人工仿野生栽培開發(fā)[9]，主要的人工栽培方式有大棚仿野生、活樹仿野生、林下仿野生、死樹仿野生、石頭仿野生、巖壁仿野生等。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定以多糖、甘露糖和醇溶性浸出物為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行品質(zhì)控制[10]，傳統(tǒng)以“質(zhì)重，嚼之粘牙，口甜，無(wú)渣者為優(yōu)”。不同栽培方式鐵皮石斛藥效含量的高低，已成為藥農(nóng)們關(guān)注的重點(diǎn)。近年來(lái)雖有對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、不同種質(zhì)、不同生長(zhǎng)年限鐵皮石斛多糖和單糖的研究報(bào)道[11-13]，也有對(duì)鐵皮石斛莖和葉中多糖甘露糖含量的報(bào)道[14]，但未見不同仿野生栽培鐵皮石斛多品質(zhì)指標(biāo)比較研究。本文通過(guò)對(duì)不同栽培方式下鐵皮石斛多糖、甘露糖、多酚、黃酮、浸出物、粗纖維含量的測(cè)定，以純野生鐵皮石斛為對(duì)照，探索不同栽培方式下鐵皮石斛藥效成分含量的差異，為人工栽培優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試樣采自樂(lè)清市雁蕩山鐵皮石斛基地生產(chǎn)的活樹仿野生、死樹仿野生、大棚仿野生、石頭仿野生、巖壁仿野生、林下仿野生栽培的鐵皮石斛鮮莖，品種均為雁蕩本地種，每種栽培方式采集3家企業(yè)生產(chǎn)的3份樣品，每個(gè)植株采集1～2個(gè)二年生萌條，每份樣品500 g，以藥農(nóng)采集的純野生鐵皮石斛作對(duì)照，經(jīng)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鑒定為蘭科植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)的莖。樣品于102 ℃烘干后，經(jīng)粉碎、干燥恒重后備用，樣品由浙江省農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 儀器

Alliance-2695 高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；SPECORD 210 plus紫外-可見分光光度計(jì)(德國(guó)analytik jena公司)；分析天平(Sartorius感量0.1 mg)；SK5200HP 超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；XTERRA RP-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；水浴鍋(江蘇金壇國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠)；TDZ4A-WS低速離心機(jī)(湘儀公司)；Finnpipette移液器(Thermo公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

1.3 試劑

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、鹽酸氨基葡萄糖(HAG)、氫氧化鈉、三氯甲烷、乙酸銨、濃鹽酸、苯酚、硫酸、乙醇、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鋁、乙酸鉀均為分析純；乙腈、甲醇為色譜純；D-甘露糖(D-Man)和D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為生化試劑；多酚(沒(méi)食子酸)、黃酮(蘆丁)對(duì)照品購(gòu)自北京方程生物科技有限公司，水為娃哈哈純凈水。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 多糖含量測(cè)定

參照2010年版《中國(guó)藥典》的方法[15]。

對(duì)照品溶液的制備。取105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并定量制成每1 mL中含100 μg的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加水至1.0 mL，精密加5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出放入冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)的試劑為空白，用紫外-可見分光光度法在488 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液的制備。取樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.3 g，精密稱定，加水200 mL，加熱回流提取2 h，提取液轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，用適量水分次洗滌容器，洗液轉(zhuǎn)移至同一量瓶中，冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液2 mL，置25 mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心(4 000 r·min-1)20 min，棄去上清液(必要時(shí)濾過(guò))，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

測(cè)定。精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)目下的方法，自“精密加5%苯酚溶液1 mL”起，依方法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的量，并進(jìn)行計(jì)算。

1.4.2 甘露糖含量檢測(cè)

參照2010年版《中國(guó)藥典》中高效色譜法(附錄Ⅵ D)[15]。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備。取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液。

對(duì)照品溶液的制備。取甘露糖對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加水適量使溶解，用水定容至刻度，搖勻。

供試品溶液的制備。取樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)0.100 0 g，精密稱定，加80%乙醇索氏提取4 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開后置于燒杯中，加水100 mL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，煎煮并時(shí)時(shí)攪拌，煎煮1 h，放冷，加水補(bǔ)至約100 mL，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL置于安瓿瓶或頂空瓶中，加入3.0 mol·L-1的鹽酸溶液0.5 mL，封口，混勻，110 ℃水解1 h。冷卻后，開封，用3.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。

測(cè)定。取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1.0 mL，分別加0.5 mol·L-1的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液與0.3 mol·L-1的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min。再加0.3 mol·L-1的鹽酸溶液500 μL，用三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，棄去三氯甲烷液，水層離心(4 000 r·min-1)10 min后收集上清液，即得供試品溶液。取上清液10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.02 mol·L-1的乙酸銨溶液(20∶80)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

1.4.3 醇溶性浸出物含量測(cè)定

參照2010年版《中國(guó)藥典》(附錄X A)醇溶性浸出物測(cè)定法[15]。

取供試樣品粉末2.000 g放入蒸餾瓶中，加入100 mL 95%乙醇溶液浸提1 h，稱取蒸餾瓶質(zhì)量并記錄m1，在沸水浴中回流提取1 h，取出冷卻，稱取蒸餾瓶質(zhì)量加水補(bǔ)充至與m1一致，過(guò)濾。吸取濾液20 mL于烘至恒重且已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，于沸水浴上蒸干，轉(zhuǎn)移至烘箱中105 ℃烘3 h，取出至干燥器中冷卻稱重。

ω=100(m2-m1)/m。

式中，ω為試樣中浸出物含量(%)；m為樣品質(zhì)量(g)；m1為蒸發(fā)皿質(zhì)量(g)；m2為烘干后蒸發(fā)皿質(zhì)量(g)。

1.4.4 多酚含量測(cè)定

參照ISO 14502.1—2005綠茶和紅茶的物質(zhì)特性測(cè)定 第一部分 茶中總多酚的含量-Folin-Ciocalteu試劑的比色法(GB/T 8313—2008)[16]。

試液的制備。稱取0.200 0 g均勻磨碎的試樣于10 mL離心管中，加入在70 ℃中預(yù)熱過(guò)的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆驖駶?rùn)，立即移入70 ℃水浴中，浸提10 min(隔5 min攪拌1次)，浸提后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入離心機(jī)在3 500 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶。殘?jiān)儆? mL 70%甲醇溶液提取1次，重復(fù)以上操作。合并提取液定容至10 mL，搖勻。再移取1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，待測(cè)。

試液的測(cè)定。用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒(méi)食子酸工作液(1 000 μg·mL-1)1.0 mL于刻度試管內(nèi)，在每個(gè)試管內(nèi)分別加入5.0 mL的福林酚試劑，搖勻。反應(yīng)3～8 min，加入7.5%碳酸鈉溶液4.0 mL，加水定容至刻度，搖勻。室溫下放置60 min，在765 nm波長(zhǎng)條件下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。根據(jù)沒(méi)食子酸工作液的吸光度與各工作溶液的沒(méi)食子酸濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)用水作空白對(duì)照，765 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定測(cè)試液及空白對(duì)照的吸光度，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出茶多酚的濃度。

1.4.5 黃酮含量測(cè)定

參照NY/T 1295—2007蕎麥及其制品中總黃酮含量的測(cè)定[17]。

試液的制備。稱取試樣1.000 0 g，置于15 mL具塞三角瓶中，加入甲醇溶液30 mL，蓋緊瓶蓋，將三角瓶置于(65±2)℃的恒溫水浴振蕩器中在(160±10)r·min-1的振蕩頻率下振搖2 h，趁熱過(guò)濾，濾液置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液清洗濾紙和殘?jiān)?，合并濾液，冷卻至室溫，加甲醇溶液至刻度，搖勻，為試料待測(cè)液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL(相當(dāng)于蘆丁0、12.5、25、50、100、150 μg·mL-1)，移入10 mL刻度比色管中，加入30%乙醇溶液至5.0 mL，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，振搖后放置6 min，加1.0 moL·L-1氫氧化鈉溶液2 mL，30%乙醇溶液定容至刻度，以零管為空白，搖勻后用1 cm的比色杯在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或求取線性回歸方程。

試液的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取1.0 mL待測(cè)液置于10 mL容量瓶中，分別加入三氯化鋁溶液2 mL、乙酸鉀溶液3 mL，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，室溫下放置30 min。在4 000 r·min-1速度下離心10 min。于波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出總黃酮的濃度。

1.4.6 粗纖維含量檢測(cè)

參照茶粗纖維測(cè)定GB/T 310—2002[18]。

稱取樣品(18目)約為1 g，準(zhǔn)確至0.000 2 g，置入玻璃坩堝中，先用乙醚脫脂。把裝有樣品的坩堝放入福斯2010纖維測(cè)定儀加熱槽。打開電源開關(guān)，再開啟循環(huán)水加熱開關(guān)，至水燈亮，然后開啟酸加熱開關(guān)，至酸燈亮。

加入150 mL左右濃度為1.25%的熱硫酸，打開加熱電源使酸微沸，加熱回流時(shí)間為30 min，酸處理完成后必須用水徹底清洗樣品管中的樣品，使之呈中性。然后開啟堿加熱開關(guān)至堿燈亮，加入150 mL左右濃度為1.25%的氫氧化鈉，打開加熱電源使堿微沸，加熱回流時(shí)間同樣為30 min，堿處理完成后用水徹底清洗用品管中的樣品。將水濾盡，取出并用95%乙醇淋洗，然后放入105 ℃烘箱中烘4 h至恒重，冷卻后稱量。將干燥后的樣品放入550 ℃高溫爐(馬福爐)中灰化2.5 h，至恒重，冷卻30 min后稱量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量

由表1可知，不同栽培方式鐵皮石斛多糖含量(以干基計(jì))為28.62%～48.73%，平均含量35.12%，含量最高的是石頭仿野生和林下仿野生栽培的鐵皮石斛，分別為48.73%和44.15%，兩者間無(wú)顯著性差異，但極顯著地高于其他栽培的鐵皮石斛，其中純野生、大棚仿野生、巖壁仿野生、活樹仿野生栽培鐵皮石斛多糖含量之間也無(wú)顯著差異。多糖含量最低的是死樹仿野生栽培的鐵皮石斛，為28.62%。所有栽培方式鐵皮石斛多糖含量均符合2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的按干燥品無(wú)水葡萄糖(C6H12O6)計(jì)的不少于25.0%。

表1 不同栽培方式鐵皮石斛成分含量

注：同列無(wú)相同大小寫字母分別表示差異達(dá)極顯著和顯著水平。

2.2 甘露糖含量

由表1可知，不同栽培方式鐵皮石斛甘露糖含量(以干基計(jì))為19.08%～28.07%，平均含量23.01%。含量最高的是石頭仿野生和林下仿野生栽培的鐵皮石斛，分別為28.07%、26.45%，極顯著地高于大棚仿野生、巖壁仿野生、死樹仿野生、純野生、活樹仿野生栽培。所有栽培方式鐵皮石斛甘露糖含量均符合2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的按干燥品甘露糖含量(C6H12O6)應(yīng)為13.0%～38.0%。

2.3 浸出物含量

由表1可知，不同栽培方式鐵皮石斛醇溶性浸出物(以干基計(jì))含量為4.04%～16.05%，平均含量7.21%，含量最高的為純野生鐵皮石斛，達(dá)16.05%，極顯著地高于其他栽培方式。其次為巖壁仿野生、活樹仿野生栽培方式，浸出物含量分別是6.53%和6.16%，極顯著地高于林下仿野生、石頭仿野生和死樹仿野生栽培方式。浸出物含量之間無(wú)顯著差異，浸出物含量最低的是死樹仿野生栽培方式，為4.04%。只有純野生、巖壁仿野生栽培鐵皮石斛浸出物含量符合2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的醇溶性浸出物含量不得少于6.5%。

2.4 多酚含量

由表1可知，不同栽培方式鐵皮石斛多酚含量(以干基計(jì))為0.31%～0.66%，平均含量0.43%，含量最高的是純野生鐵皮石斛，為0.66%，極顯著地高于其他栽培方式。其次為活樹仿野生栽培的鐵皮石斛，多酚含量為0.51%，極顯著地高于巖壁仿野生、林下仿野生、石頭仿野生、死樹仿野生栽培的鐵皮石斛。多酚含量最低的是大棚仿野生栽培鐵皮石斛，為0.31%。黃琴等[20]研究表明，鐵皮石斛4個(gè)不同極性提取物均具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且各提取物抗氧化活性與總酚含量和總黃酮含量之間有明顯的相關(guān)性，表明鐵皮石斛抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)可能就是酚類或黃酮類成分，說(shuō)明鐵皮石斛藥材的質(zhì)量，純野生者質(zhì)量?jī)?yōu)于人工栽培的。

2.5 黃酮含量

由表1可知，不同栽培方式鐵皮石斛黃酮含量(以干基計(jì))為0.09%～0.25%，平均含量0.16%；含量最高的是純野生栽培的鐵皮石斛，為0.25%，極顯著地高于其他栽培方式。其次為林下仿野生、巖壁仿野生栽培的鐵皮石斛，含量分別為0.17%和0.16%，顯著地高于活樹仿野生、死樹仿野生、石頭仿野生栽培的鐵皮石斛。黃酮含量最低的是大棚仿野生栽培鐵皮石斛，為0.09%，說(shuō)明鐵皮石斛藥材的質(zhì)量，以純野生者質(zhì)量?jī)?yōu)于人工栽培。

2.6 粗纖維含量

由表1可知，不同栽培方式鐵皮石斛粗纖維含量(以干基計(jì))9.63%～16.49%，平均含量11.69%，含量最低的是石頭仿野生、死樹仿野生、林下仿野生栽培鐵皮石斛，分別為9.63%、9.76%、9.85%；含量最高的是純野生鐵皮石斛，為16.49%，極顯著地高于其他栽培方式。其次為活樹仿野生栽培的鐵皮石斛，含量為13.29%，顯著地高于其他栽培方式，說(shuō)明所有人工栽培的鐵皮石斛粗纖維含量均較純野生的要低得多。這是因?yàn)榧円吧蔫F皮石斛生長(zhǎng)于人跡罕至的懸崖峭壁上陰面崖縫間，根不入土，常年飽受云霧雨露滋潤(rùn)，生長(zhǎng)年限長(zhǎng)，純野生鐵皮石斛質(zhì)地結(jié)實(shí)，粗纖維含量最高。

3 小結(jié)

多糖是鐵皮石斛的主要有效成分，多糖成分能夠清除自由基，具有抗氧化活性。石頭仿野生和林下仿野生栽培的鐵皮石斛多糖和甘露糖含量極顯著地高于其他栽培方式。不同仿野生栽培鐵皮石斛多糖、甘露糖含量均符合2015版中國(guó)藥典的規(guī)定，說(shuō)明不同人工栽培方式生產(chǎn)的鐵皮石斛均可替代野生鐵皮石斛。不同栽培方式下鐵皮石斛粗纖維含量最高的是純野生鐵皮石斛，極顯著地高于其他栽培方式。含量最低的是石頭仿野生、死樹仿野生、林下仿野生栽培的鐵皮石斛。石頭仿野生和林下仿野生栽培的鐵皮石斛多糖和甘露糖含量高、粗纖維含量低，說(shuō)明純野生鐵皮石斛的生態(tài)環(huán)境不如人工栽培的優(yōu)越，石頭仿野生和林下仿野生栽培生態(tài)環(huán)境更接近純野生且營(yíng)養(yǎng)狀況又優(yōu)于純野生，比較適合鐵皮石斛多糖和甘露糖含量的積累。

不同栽培方式鐵皮石斛醇溶性浸出物(以干基計(jì))含量最高的是純野生鐵皮石斛，達(dá)16.05%，極顯著地高于其他任何栽培方式；其次為巖壁仿野生、活樹仿野生栽培，極顯著地高于大棚仿野生栽培、林下仿野生、石頭仿野生和死樹仿野生栽培，含量最低的是死樹仿野生栽培方式。

不同栽培方式鐵皮石斛多酚和黃酮含量最高的也均是純野生鐵皮石斛，極顯著地高于其他栽培方式；多酚和黃酮含量最低的均是大棚仿野生栽培鐵皮石斛，說(shuō)明大棚仿野生栽培的鐵皮石斛在醇溶性浸出物、多酚和黃酮含量上與純野生鐵皮石斛仍存在極顯著差異，有較大的提升空間，很多栽培措施有待進(jìn)一步的深入研究。