賀建超，馬英輝，李利軍，盧美歡

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

蜜環(huán)菌(Armillariellamellea)屬真菌界、擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、蜜環(huán)菌屬，同蘭科天麻(Gastrodiaelata)互為寄生。天麻染此菌后，菌索迅速消失，進而共同生長發(fā)育。天麻開花結(jié)籽后，蜜環(huán)菌又迅速吃掉天麻塊莖。夏秋雨季蜜環(huán)菌常見于針、闊葉樹干基部叢生，使樹根腐至可發(fā)熒光。蜜環(huán)菌深層發(fā)酵物功同天麻，有息風(fēng)鎮(zhèn)痛，治神經(jīng)性頭疼，高血壓性頭痛之效。均對中樞神經(jīng)起鎮(zhèn)靜作用，可與中樞抑制劑，戊巴比妥納協(xié)同作用，延長小白鼠睡眠。與中樞興奮劑五甲烯四氫唑拮抗，增進大腦和冠狀動脈血流量。舒筋活絡(luò)，強筋壯骨。治腰腿疼痛，半身不遂，佝僂癥[1]。

有機硒具有抗氧化、抗衰老、抗癌、提高機體免疫力等多種生物學(xué)功能。我國硒資源儲量豐富，但地理分布不均勻，城鄉(xiāng)居民硒攝入量不足，是公認的缺硒大國。近十多年來，我國富硒農(nóng)產(chǎn)品備受市場關(guān)注和青睞，呈現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景[2]。有機鍺具有抗癌誘發(fā)機體干擾素的產(chǎn)生降低血壓提高機體免疫等功能并且毒性極低， 由于名貴藥材如靈芝、猴頭菌、蜜環(huán)菌等中有機鍺含量較低，近年來國內(nèi)外有研究報道用二氧化鍺作為添加劑培養(yǎng)食用和藥用真菌，獲得高含量的生物源有機鍺[3]。筆者選用不同的培養(yǎng)基，添加不同含量的亞硒酸鈉和二氧化鍺進行研究?，F(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

蜜環(huán)菌AY3菌株，系陜西省微生物研究所真菌研究中心保藏菌種。

綜合PDA液體培養(yǎng)基[4]。土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，維生素B1為10 mg，水1 000 mL。

添加劑亞硒酸鈉(化學(xué)純，上海試劑廠)；二氧化鍺(高純試劑，上海試劑廠)。

1.2 方法

將綜合PDA液體培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖替換成麥芽糊精、紅薯淀粉、土豆淀粉、可溶性淀粉，分裝在三角瓶中，每瓶100 mL，于1.2 kg·cm-2滅菌30 min。冷卻至25 ℃，接種蜜環(huán)菌，25 ℃下靜置培養(yǎng)21 d，過濾菌索體，烘干稱重。

采用綜合PDA液體培養(yǎng)基分裝三角瓶，每瓶100 mL，在1.2 kg·cm-2壓力下滅菌30 min。冷卻至25 ℃，接種蜜環(huán)菌，25 ℃下培養(yǎng)7 d，分別添加亞硒酸鈉0、50、100、150、200、250、300、350、400 mg·L-1[5-6]；分別添加二氧化鍺0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mg·L-1，25 ℃下靜置再培養(yǎng)14 d[7-8]，過濾菌索體，烘干稱重。

蜜環(huán)菌粗多糖提取方法[9-10]。稱取蜜環(huán)菌菌索粉5 g，加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻，于95 ℃水浴中保溫4 h，中間每隔20 min超聲震動20 s，完成后3 500轉(zhuǎn)離心20 min，得上清液(1)。再加入50 mL蒸餾水攪拌均勻，于95 ℃水浴中保溫4 h，中間每隔20 min超聲震動20 s，再提取1次，離心后得上清液(2)。將上清液(1)和(2)合并，加入總體積3倍的無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置沉淀48 h。3 500轉(zhuǎn)離心后得沉淀于80 ℃烘干，即為蜜環(huán)菌粗多糖樣品。

蜜環(huán)菌粗多糖含量測定采用苯酚硫酸法[11]。精密稱取蜜環(huán)菌菌索粉1 g，置索氏提取器中，先用無水乙醇加熱回流后，再加水90 mL，加熱回流提取至無色，將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 mL，加入無水乙醇150 mL搖勻，4 ℃放置12 h取出，離心，棄上清液加水溶解，并定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中稀釋至刻度。

標準曲線繪制。精密稱取葡萄糖對照品配成0.1 mg·mL-1溶液，用移液槍分別吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，置10 mL具塞試管中，加水至2 mL，加入1 mL 5%苯酚，再緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴顯色20 min，冷卻后490 nm測吸光值。標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線濃度

樣品測定。取蜜環(huán)菌提取液0.5 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2 mL，加入1 mL苯酚，再緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴顯色20 min，冷卻后490 nm測吸光值。重復(fù)3次，取平均值計算多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對蜜環(huán)菌發(fā)酵的影響

由圖2可知，葡萄糖、麥芽糊精、土豆淀粉、紅薯淀粉、可溶性淀粉，蜜環(huán)菌菌索生物量干重分別為14.15、18.05、11.95、13.40、14.45 g·L-1。

圖2 不同碳源對蜜環(huán)菌發(fā)酵的影響

2.2 亞硒酸鈉對蜜環(huán)菌的影響

由圖3可知，添加亞硒酸鈉0、50、100、150、200、250、300、350、400 mg·L-1，蜜環(huán)菌菌索生物量干重分別為18.0、19.2、20.1、21.3、22.2、23.1、25.6、24.3、20.2 g·L-1，蜜環(huán)菌粗多糖含量分別為18.63、18.61、19.53、20.01、21.20、22.30、23.60、22.30、20.10 mg·g-1。

圖3 添加硒對蜜環(huán)菌的影響

2.3 二氧化鍺對蜜環(huán)菌的影響

由圖4可知，添加二氧化鍺對照0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mg·L-1，蜜環(huán)菌菌索生物量干重分別為10.4、9.0、10.75、10.7、10.5、11.3、12.4、12.8、13.0、13.4、15.6、15.6、15.0 g·L-1，蜜環(huán)菌粗多糖含量5.82、5.81、6.04、6.10、5.98、6.12、6.14、6.20、6.21、6.35、7.86、7.46、7.15 mg·g-1。

圖4 添加鍺對蜜環(huán)菌的影響

2.4 混合添加對蜜環(huán)菌的影響

添加硒300 mg·L-1和鍺500 mg·L-1，蜜環(huán)菌生長不良，菌索生物量為3.5 g·L-1。硒和鍺均添加1.5 μg·mL-1則生長良好，蜜環(huán)菌菌索生物量為12.95 g·L-1。

蜜環(huán)菌多糖含量。對照多糖含量為20 mg·g-1，添加硒100 mg·L-1后多糖含量為30 mg·g-1，添加鍺400 mg·L-1后多糖含量40 mg·g-1，添加硒100 mg·L-1和添加鍺400 mg·L-1后的多糖含量為36.67 mg·g-1，添加硒150 mg·L-1和添加鍺450 mg·L-1后的多糖含量為30 mg·g-1。

3 小結(jié)與討論

在5種碳源中，麥芽糊精的蜜環(huán)菌生物量最高，達18.05 g·L-1。當亞硒酸鈉添加量350 mg·L-1時，生物量和粗多糖含量開始下降；當亞硒酸鈉添

加量為300 mg時，蜜環(huán)菌的生物量和粗多糖含量均為最高值。當二氧化鍺添加量為600 mg·L-1時，生物量和粗多糖含量開始下降；當二氧化鍺添加量為500 mg·L-1時，蜜環(huán)菌的生物量和多糖含量均為最高值。

低濃度微克級硒和鍺能促進蜜環(huán)菌菌絲生長，其機理可能是硒和鍺可進入細胞內(nèi)部并與有機羧酸絡(luò)合成硒鹽和鍺鹽從而影響細胞某些酶類的活性變化。高濃度的硒和鍺混合添加可抑制蜜環(huán)菌菌索的生長，低濃度(微克級)的硒和鍺混合添加對蜜環(huán)菌菌索抑制不大，微克級的硒和鍺對人毒性小。每天口服1 g添加1.5 μg·mL-1硒鍺蜜環(huán)菌菌索粉對人體無毒，具有鎮(zhèn)靜安眠作用，還具有降低血糖和抗癌防癌的功效。2011年中國營養(yǎng)學(xué)會最新推薦成人每天硒攝入量為60～250 μg。建議添加微克級硒和鍺，因為高濃度的硒和鍺對蜜環(huán)菌和人體有毒害作用。