李德利，方明月，王青青，劉雙月，賡迪，王如峰*，馬超

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

金蓮花又名旱金蓮、旱荷、金梅草、金疙瘩等，是毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花，具有清熱解毒、消腫明目的功效[1-2]。近年臨床研究報告顯示，金蓮花在治療急性咽炎、風(fēng)熱感冒等方面療效顯著，已有多種劑型運用于臨床，有報道稱金蓮花抗炎的作用甚至高于臨床常用的抗炎藥[3-4]。金蓮花化學(xué)成分明確，主要化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類和生物堿類。其中，黃酮類的含量最高，總黃酮約占金蓮花干重的16%[5-6]，被認(rèn)為是金蓮花中最主要的活性物質(zhì)。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，金蓮花的不同花部，即花萼、花冠、花蕊群(雄蕊和雌蕊)、子房、花柄中的總黃酮含量存在差異[7]；但是還不清楚它們的抗炎活性是否也有所不同，各花部的抗炎活性與其總黃酮含量是否存在相關(guān)性。為此，本文采用細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型研究了金蓮花各花部提取物對一氧化氮(NO)分子釋放量的影響，并結(jié)合各花部提取物的總黃酮含量測定，對各花部提取物的抗炎活性與其總黃酮含量的相關(guān)性進(jìn)行了探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，METTLER AE240型1/10萬電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生物儀器廠)，MC-18AIC(UV)CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)，SW-CJ-10潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，ECLIPSETE2000-S倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)，Epoch全自動酶標(biāo)儀(Bio Tek公司)，30～300 μL八道移液器(Eppendorf公司)，1000 μL/200 μL/20 μL單道移液器(Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

金蓮花購自河北安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花。葒草素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：YD0001502-171110)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)；實驗試劑乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磺胺、1-萘胺均為分析純。

2 方法

2.1 花部提取物的制備

將金蓮花按各花部(花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄)分離，取材如圖1所示。稱取各花部10 g，95%乙醇超聲提取2次，第一次30倍量乙醇提取30 min，第二次40倍量乙醇提取30 min，合并兩次提取液，四層紗布過濾，常溫下減壓濃縮，揮干至恒重，即得金蓮花各花部提取物，各花部提取率為提取物質(zhì)量/花部質(zhì)量[8]。

圖1 金蓮花花部模式圖

2.2 花部提取物總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取葒草素對照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加適量95%乙醇，50 ℃水浴加熱溶解，放冷，用95%乙醇稀釋至刻度。精密量取25 mL于50 mL量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，即得對照品溶液。其中葒草素的質(zhì)量濃度為200 mg·L-1。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對照品溶液0、1、3、5、7、9、11 mL，分別置于25 mL量瓶中，加95%乙醇至11 mL，搖勻；然后，分別加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻；放置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻；再放置6 min后，加入4% NaOH 溶液10 mL；最后，用95%乙醇稀釋至體積，搖勻。放置15 min后，以第一管作為空白對照，用比色法在510 nm處測定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程[8]。

2.2.3 總黃酮含量測定 稱取各花部醇提取物20 mg，于1 mL 95%乙醇中完全溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，量取0.5 mL于25 mL容量瓶中。同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，測定510 nm處吸光度(A)值，由線性回歸方程計算各花部提取物總黃酮質(zhì)量濃度。依公式(1)計算各花部提取物總黃酮含量(W)。各花部生藥總黃酮含量為提取物總黃酮含量×提取率。

(1)

式中：C為質(zhì)量濃度，V為測定體積，N為稀釋倍數(shù)，M為總提取物質(zhì)量，m為測定質(zhì)量。

2.3 抗炎活性實驗

2.3.1 最大無毒濃度 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，制成密度為1.5×105個·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中培養(yǎng)，每孔100 μL。培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，棄去舊的培養(yǎng)液，依次加100 μL含藥培養(yǎng)液(80、160、320、640 μg·mL-1各花部提取物和25、50、100、200、400 μmol·L-1阿司匹林)，空白對照組加等量含有PBS的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個平行孔。藥物作用于細(xì)胞20 h后，棄去含藥培養(yǎng)液，每孔加入質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度(A)值，檢測波長為490 nm。根據(jù)測得的A值計算細(xì)胞存活率。

2.3.2 抗炎實驗 通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，Griess試劑法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO釋放量，能直觀反映炎癥的發(fā)生，因此以評價NO分子的分泌量來篩選抗炎藥物是一種普遍運用且簡單可行的方法[9-10]。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，制成密度為1.5×105個·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液。加入新鮮的含藥和LPS的培養(yǎng)基120 μL，其中LPS質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1。設(shè)空白對照組、陰性對照組、陽性對照組(阿司匹林 25、50、100、200、400 μmol·L-1)和不同劑量加藥組(16、32、64 μg·mL-1各花部提取物)，培養(yǎng)20 h后吸取上清液，加入Griess試劑A液(1%磺胺)，混合均勻后37 ℃孵育10 min，再加入Griess 試劑B液(0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽)，混合均勻后37 ℃孵育10 min。在自動酶標(biāo)儀上測定540 nm下的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 8X+0.049 9(r=0.999 8)求出各組的NO濃度，按公式(2)計算NO抑制率。

(2)

式中：CLPS組為LPS組NO質(zhì)量濃度，C實驗組為實驗組NO質(zhì)量濃度。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 花部提取物總黃酮含量

以已知濃度的葒草素為對照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.003 6X+0.044 3(r=0.999 7)，表示對照品在8～88 μg·mL-1線性關(guān)系良好。金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄中均含黃酮類成分，但各花部提取物之間的總黃酮含量存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。各花部提取物中總黃酮含量順序為：花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群；結(jié)合各花部的提取率，計算各花部生藥的總黃酮含量順序為花萼>花柄>花冠>子房>花蕊群。具體含量見表1。

表1 金蓮花各花部及提取物中總黃酮含量

注：各花部提取物及花部之間比較，**P<0.01。

3.2 花部抗炎活性

3.2.1 最大無毒濃度 采用MTT法測定了不同質(zhì)量濃度的金蓮花5個花部提取物及陽性藥阿司匹林對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖2所示。金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、花柄4個花部提取物質(zhì)量濃度在80～640 μg·mL-1時，子房提取物質(zhì)量濃度在80～320 μg·mL-1時細(xì)胞存活率與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，表明在此質(zhì)量濃度下，各花部提取物對RAW264.7細(xì)胞的正常生長無毒性影響。陽性對照組阿司匹林在實驗濃度(25、50、100、200、400 μmol·L-1)下對RAW264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。

注：**P<0.01表示該提取物質(zhì)量濃度下具有細(xì)胞毒性。圖2 各花部提取物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

3.2.2 抗炎活性結(jié)果 LPS組與空白對照組相比，NO釋放量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；陽性藥阿司匹林對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量具有明顯的抑制作用，其NO釋放量比LPS組明顯減少，且各濃度均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，如圖3所示，表示LPS能誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，該細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功。

注：與LPS組相比，**P<0.01。圖3 阿司匹林對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

利用上述構(gòu)建的細(xì)胞模型，用Griess試劑法測定了金蓮花5個花部提取物在16～64 μg·mL-1對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO分子的釋放量。與LPS組相比，花蕊群和子房兩個部位在實驗濃度下對NO釋放量有顯著性抑制作用(P<0.01)，花萼和花柄濃度在32～64 μg·mL-1時，抑制作用明顯(P<0.01)，花萼在16 μg·mL-1時抑制作用較弱(P<0.05)，而花冠只在最高濃度即64 μg·mL-1時表現(xiàn)出抑制作用(P<0.05)，如圖4所示。由抑制率公式計算NO抑制率，結(jié)果如表2所示，相同質(zhì)量濃度下花蕊群和子房提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的抑制率比其他花部高，且二者的抑制率之間無差異。其次是花萼和花柄提取物，二者對NO釋放抑制作用的效果相當(dāng)，均高于花冠提取物。

注：與LPS組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各花部提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

表2 各花部提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放的抑制率

注：和花蕊群比較，#P<0.05，##P<0.01；和子房比較，△P<0.05，△△P<0.01；和花萼比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3.3 各花部提取物抗炎活性與其總黃酮含量的相關(guān)性

金蓮花各花部的提取物具有良好的抗炎活性，為直觀反映提取物抗炎活性與其總黃酮含量之間的關(guān)系，根據(jù)3.1項下結(jié)果，計算實驗條件下(16、32、64 μg·mL-1，加藥體積100 μL)各花部提取物中的總黃酮含量，其與NO分子釋放抑制率對應(yīng)關(guān)系如圖5所示。在本實驗濃度范圍內(nèi)，各花部提取物對NO分子釋放的抑制率與各自總黃酮含量之間存在劑量依賴性；即同一花部，提取物總黃酮含量越高，對NO分子釋放的抑制作用越強(qiáng)；但從不同花部之間比較來看，各花部提取物對NO分子的抑制率與總黃酮含量之間無明顯關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=-0.035 71，P>0.05)。如子房和花蕊群兩個花部提取物中的總黃酮含量較其他花部少，抑制率卻最高；花萼和花柄部位提取物的總黃酮含量最高，但對NO分子釋放的抑制效果并不是最好。

圖5 花部提取物總黃酮含量與NO釋放抑制率的關(guān)系

4 討論

金蓮花各花部提取物及花部之間的總黃酮含量存在顯著差異，即花部之間：花萼>花柄>子房>花蕊群>花冠，與文獻(xiàn)報道一致[7]；提取物中：花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群。為進(jìn)一步明確各花部提取物中總黃酮含量和抗炎活性之間的關(guān)系，借助LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型，研究了相同質(zhì)量濃度下不同花部提取物對細(xì)胞NO分子釋放量的影響。NO分子在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，參與致炎因子的分布和損傷等病理過程。通常炎癥發(fā)生時，NO分子的釋放量明顯增加[11-12]。本文通過計算各花部提取物對NO分子的抑制率來表征各花部提取物的抗炎作用，結(jié)果表明金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄提取物均能抑制NO分子的產(chǎn)生，表現(xiàn)出一定程度的抗炎作用，且子房和花蕊群>花萼和花柄>花冠提取物。結(jié)合各花部提取物中的總黃酮含量測定結(jié)果，表明金蓮花不同花部抗炎活性的強(qiáng)弱與各花部提取物中總黃酮的含量不成正比，提示黃酮類成分并不是金蓮花抗炎活性的唯一藥效物質(zhì)。本課題組前期關(guān)于金蓮花各花部的指紋圖譜研究[13]也表明，雖然子房和花蕊群與其他花部的指紋圖譜相似，但是其主要黃酮類成分的含量卻低于其他花部。因此，除了黃酮類之外，金蓮花的抗炎活性成分還應(yīng)包含酚酸類和生物堿類等其他結(jié)構(gòu)類型。