程 蕾，辛友東，胡修忠，向 敏，劉曉華，王定發(fā)，余 婕，周 源，譚明夏，夏 瑜，陶碧菲

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學 動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070 )

精液的冷凍與解凍是家畜育種體外受精技術中常見的操作步驟，但精液的冷凍-解凍以及精子洗滌過程會導致氧化應激，特別是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，而ROS可引起多種類型的精子損傷，包括膜脂過氧化、細胞內(nèi)蛋白滲漏和DNA斷裂。因此，冷凍解凍后的精子活力、運動性以及受精潛力通常會降低[1]。谷胱甘肽(glutathione)是精漿和精子細胞中最重要的非酶抗氧化劑，Stradaioli等[2]研究表明，精子在冷凍過程中還原型谷胱甘肽(GSH)的含量會降低，從而導致精子活力和運動能力的顯著降低。而在冷凍解凍過程中向精液或精子稀釋液中直接加入外源性谷胱甘肽對精子可起到一定的保護作用[3-5]。染料木黃酮(genistein)是一種異黃酮，被認為是精子產(chǎn)生超氧負離子自由基和過氧自由基時的ROS清除劑，也是蛋白酪氨酸激酶的非選擇性抑制劑[6]。已有研究證實10 μM genistein可以略微增加人類直線運動的精子活率以及總體活率[7]?？Х纫?caffeine)是一種環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的非選擇性抑制劑，在1971年就被證實對精子活力存在有益作用[8]，之后的研究也表明caffeine能夠刺激人類[9]、豬[10]、牛[11]等物種的精子運動性。

雖然已有研究報道了GSH、caffeine和genistein對精液冷凍解凍過程中精子的影響，但目前還沒有關于caffeine與GSH或genistein的聯(lián)合應用對精子運動性以及體外受精能力影響的報道。精子暴露在活性氧環(huán)境下會導致受精過程異常，同時也會改變體外胚胎的發(fā)育，這引起了學者們的廣泛關注。雖然精子運動實驗可以評估有關活性氧對精子受精能力的影響，但是這一因素對胚胎發(fā)育的影響是不能單獨用這些實驗來確定。因此，本試驗擬通過計算機輔助精子分析(CASA)系統(tǒng)來評估GSH、caffeine和genistein單獨和聯(lián)合應用對牛各種精子參數(shù)的影響，并且結合體外受精試驗全面評價這三種物質(zhì)對體外受精后胚胎發(fā)育情況的影響，為三種物質(zhì)在奶牛冷凍精液體外受精以及體外胚胎生產(chǎn)中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 精液制備

將來自5頭健康牛的5管(0.25 mL)凍精在37 ℃水浴40s解凍，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，300 g離心5 min，去除上層精清，然后加入600 μL的Sp-TALP 或 Fert-TALP 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min。精子上浮結束后，將每等份50 μL(25×106個/mL)的精子懸液轉(zhuǎn)移到1 mL的離心管中，根據(jù)試驗設計添加不同組合的GSH、caffeine和genistein，本試驗包括7個組，分別是(1)對照組(不添加任何物質(zhì))；(2)5 mM GSH[2]；(3)5 mM caffeine[9,11]；(4)10 μM genistein[7]；(5)5 mM GSH +5 mM caffeine；(6)10 μM genistein + 5 mM caffeine；(7)5 mM GSH + 10 μM genistein。于37 ℃(Sp-TALP)或38.5 ℃(Fert-TALP)飽和濕度下孵育，定時取樣進行精子參數(shù)的分析。

1.2 精子運動參數(shù)檢測

利用CASA系統(tǒng)對精子參數(shù)進行評估(SPJ-1系統(tǒng)，徐州圣普)。為了避免誤差，所有的實驗操作均由一熟練的人員操作。本次試驗配套使用了Makler計數(shù)池和恒溫版，將Sp-TALP 或 Fert-TALP 培養(yǎng)基輕輕地混勻，取10 μL精子懸液放置在Makler計數(shù)池中心并蓋上蓋玻片。每次試驗至少取8個不同視野，跟蹤和記錄200個以上精子。對于公牛精液分析的主要軟件設置如下：顯微鏡放大200倍視野下精子識別大小為2～5 μm，目標大小范圍為 25～125 μm2，圖像的采集幅數(shù)為30幀/秒。精子分析參數(shù)包括：總的精子活率(TM，%)，A級(快速前向運動，%) 、B級(慢速前向運動，%)、C級(非前向運動，%)、D級(極慢或不動，%)，直線運動精子活率(PM，%)，平均路徑速度(VAP，μm/s)，平均直線速度(VSL，μm/s), 平均曲線速度(VCL，μm/s)，平均側(cè)擺幅度(ALH，μm)，平均鞭打頻率(BCF，Hz)，平均移動角度(MAD，°)，前向性(STR，%)，線性度 (LIN，%)和擺動性(WOB，%)。

在前期的初步試驗中對精子在Sp-TALP培養(yǎng)基中孵育1 h, 2 h, 3 h, 4 h 和5 h后的精子參數(shù)均進行了分析，發(fā)現(xiàn)孵化時間的延長對精子運動有負面影響，孵育3 h后直線運動精子活率顯著下降(數(shù)據(jù)未顯示)。更重要的是，直線運動精子活率與體外受精率直接相關[17]?；诖耍驹囼炛袑p-TALP培養(yǎng)基中的精子于37 ℃飽和濕度下孵育2 h后進行CASA分析。

Fert-TALP培養(yǎng)基稀釋精子制成懸液，孵育之前將精子獲能液(Penicilamine Hypotaurine Epinephrine，PHE)和精子懸液按照1∶3的比例混合，精子獲能后其運動性會發(fā)生變化，通常情況下在獲能液中孵育2～3 h精子會螺旋式前進，而且前進的速度會加快，即發(fā)生超活化[18]。在前期的初步試驗中對孵育不同時間后的精子參數(shù)進行抽樣分析，用咖啡因或獲能液處理精子并孵育2 h后也觀察到了這一現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，本試驗用含有獲能液的Fert-TALP培養(yǎng)基處理精子，于38.5 ℃飽和濕度下孵育2 h后進行CASA分析。

1.3 體外胚胎發(fā)育

在當?shù)赝涝讏霾杉概Ｂ殉卜湃?7 ℃含有1%雙抗的運輸鹽(9 g NaCl溶于1 L雙蒸水中，10 mL 100×雙抗)中，在1～3 h內(nèi)運回實驗室。用18號針頭從卵丘復合體中抽取直徑為2～8 mm的卵泡，并在體外培養(yǎng)至成熟。挑選有多層卵丘細胞包圍的卵母細胞復合體，用HEPES緩沖液沖洗2次，移入50 μL的受精微滴中，微滴組成：含10%胎牛血清(Gibco)的TCM-199培養(yǎng)基 (Gibco)、 2.5 mM丙酮酸鈉、1 μg/mL 17β-雌二醇、0.5 IU/mL促黃體生成素(中科院北京動物所)、0.5 IU/mL卵泡刺激素(中科院北京動物所)、50 ng/mL表皮生長因子(Invitrogen)以及1%青鏈霉素(Gibco)。38.5 ℃，5%CO2，相對飽和濕度成熟培養(yǎng)24 h。

體外受精過程中精液的制備過程和最開始描述的精液分析類似。在上浮的過程中，用Fert-TALP培養(yǎng)基將精子濃度稀釋到4.0×106個/mL。在最終使用的40 μL 微滴中的精子濃度為1×106個/mL，分別在受精滴中添加不同組合的GSH、caffeine和genistein，試驗設計同1.1，最后添加精子獲能液至微滴總體積到50 μL。于38.5 ℃，5%CO2，相對飽和濕度下進行孵育。精子和卵母細胞經(jīng)過2 h的共培養(yǎng)，將受精卵轉(zhuǎn)移到含有mSOF介質(zhì)的胚胎發(fā)育微滴中進行體培養(yǎng)。在第3 d(受精當天為0 d)統(tǒng)計胚胎的卵裂率，并用新鮮的mSOF培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)換液。在第7 d或8 d統(tǒng)計囊胚率。在胚胎發(fā)育的不同時期：卵裂、桑椹胚以囊胚形成期分析谷胱甘肽、染料木黃酮以及咖啡因單獨或聯(lián)合使用對胚胎發(fā)育的影響。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SigmaStat3.5統(tǒng)計軟件分析。試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤(X±SEM)”表示，使用單因素方差分析程序進行數(shù)據(jù)分析。當方差分析結果表明模型有顯著的影響，利用Holm-Sidak多重比較檢驗確定是否存在顯著差異。用 Fisher LSD法進行胚胎發(fā)育的數(shù)據(jù)分析。對于所有的分析，P<0.05則認為是顯著的。

2 結果與分析

2.1 對Sp-TALP培養(yǎng)基中精子參數(shù)的影響

如表1所示，處理組5 mM GSH+5 mM caffeine的精子活率、VCL和BCF顯著高于10 μM genistein+5 mM caffeine處理組(P<0.05)。另外，處理組5 mM GSH + 5 mM caffeine以及10 μMgenistein 的精子運動參數(shù)VAP、VSL和BCF均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同組合處理2 h后Sp-TALP培養(yǎng)基中的精子參數(shù)Table 1 The effects of different treatment groups on sperm parameters in Sp-TALP medium after 2 h of incubation

注：同行數(shù)據(jù)肩標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Notes: Values with different letters within the same row are significantly different(P<0.05).The same below.

2.2 對Fert-TALP培養(yǎng)基中精子參數(shù)的影響

精子在PHE混合物中獲能后，所有處理組中的精子均發(fā)生了超活化，本試驗對7種方法處理2 h后的精子進行了精子動力學參數(shù)分析(表2)。7種不同的處理方式對精子的總活力沒有顯著性的影響。與對照組相比，5 mM GSH + 5 mM caffeine處理后直線運動精子活率顯著增加(P<0.05)，同時精子運動參數(shù)(VCL，BCF和MAD)顯著增加(P<0.05)。另外，5 mM GSH + 5 mM caffeine處理后精子運動參數(shù)(VAP、VCL以及MAD)顯著高于5 mM GSH以及5 mM caffeine處理組(P<0.05)。10 μM genistein處理精子后，直線運動精子活率顯著高于對照組(P<0.05)，其他參數(shù)例如VAP、VCL、BCF以及WOB高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表3比較了Sp-TALP培養(yǎng)基和Fert-TALP培養(yǎng)基中精子運動參數(shù)的差異情況。結果顯示，對照組經(jīng)PHE混合物處理后精子運動參數(shù)PM、VAP、VSL和A級精子比率均顯著低于沒有經(jīng)過PHE混合物處理的精子(P<0.05)。然而，對于5 mM GSH + 5 mM caffeine處理組，F(xiàn)ert-TALP培養(yǎng)基中精子VCL顯著高于Sp-TALP 培養(yǎng)基(P<0.05)，但運動參數(shù)LIN、WOB以及C級精子比率顯著低于Sp-TALP 培養(yǎng)基(P<0.05)。此外，10 μM genistein處理組的精子在獲能前后的運動參數(shù)無顯著變化。

表2 不同組合處理2 h后Fert-TALP培養(yǎng)基中的精子參數(shù)Table 2 The effects of different treatment groups on sperm parameters in Fert-TALP medium after 2 h of incubation

表3 不同組合處理2 h后Sp-TALP培養(yǎng)基與Fert-TALP培養(yǎng)基中的精子參數(shù)比較Table 3 A comparison of the effects of different treatment groups on sperm parameters in Sp-TALP and Fert-TALP medium after 2 h of incubation

2.3 對體外受精后的早期胚胎發(fā)育的影響

不同處理組牛卵母細胞胚胎發(fā)育的試驗結果如表4所示，7種處理組的卵裂率和囊胚率差異不顯著(P>0.05)。5 mM GSH + 5 mM caffeine處理組的桑椹胚發(fā)育率顯著高于5 mM GSH、10 μM genistein + 5 mM caffeine和10 μM genistein + 5 mM GSH處理組(P<0.05)。10 μM genistein處理組的桑椹胚發(fā)育率也顯著高于5 mM GSH以及10 μM genistein + 5 mM caffeine處理組(P<0.05)。處理組5 mM GSH + 5 mM caffeine以及10 μM genistein與對照組相比，卵裂率與桑椹胚發(fā)育率有較大幅度的提高，但差異不顯著(P>0.05)。另外，10 μM genistein處理組的囊胚發(fā)育率最高。試驗結果表明，在牛體外受精介質(zhì)中添加10 μM genistein或聯(lián)合使用 5 mM GSH與5 mM caffeine可以輕微促進牛胚胎的體外發(fā)育。

3 討 論

眾所周知，精子的凍融和洗滌等過程可能導致精子受到氧化應激而產(chǎn)生不可逆的損傷。而產(chǎn)生這些問題的主要原因是由于存在于精清和精子細胞中的清除過量ROS防止膜脂過度氧化和DNA損傷的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)(包括抗氧化分子和酶)的能力受到限制。此外，已有研究表明精漿的抗氧化系統(tǒng)在精子洗滌過程結束后幾乎完全喪失[14]，這暗示精子在體外受精的前處理過程中必然會受到ROS的負面影響。

表4 不同組合的處理組對牛IVF的影響Table 4 The effects of different treatment groups on in vitro development following IVF in Fert-TALP medium

目前的相關研究證明，冷凍解凍過程會導致人[3]、牛[15]、豬[4]等物種精子中GSH的含量以及直線運動的精子活率顯著減少。在解凍液中添加5 mM外源性谷胱甘肽可以提高人類或公豬精子的總活率和直線運動精子活率[3，16]。相反，本試驗在Sp-TALP 或Fert-TALP介質(zhì)中添加GSH (5 mM)處理精子，與對照組相比精子的總活率和直線運動精子活率并沒有增加，本研究中也沒有觀察到GSH對精子運動性或后續(xù)胚胎的體外發(fā)育有促進作用。先前的研究與本試驗的一個關鍵區(qū)別是懸浮精子細胞的方法不同。本試驗中，上浮過程結束后，精子在Sp-TALP 或 Fert-TALP介質(zhì)中重懸時只存在少量的精漿，使得精子更容易受到ROS的攻擊[13]。此外，精子在不同粘度介質(zhì)中的游動速度顯著不同[15，17-18]，在粘彈性介質(zhì)中精子的游泳速度更快[19]，而在Sp-TALP、Fert-TALP和SOF等水介質(zhì)中精子鞭毛擺動效率較低。因為在這種情況下，精子移動同樣的距離可能需要增加鞭毛和液體之間的摩擦接觸時間并消耗更多的ATP。這些變化還可能增加ROS的產(chǎn)生從而間接傷害精子。此外，精子在前進過程中的超活化也會因為鞭毛擺動時“波”的形成與傳遞的變化而受到影響[20]?；谝陨显颍茰y本試驗中Sp-TALP培養(yǎng)基中精子活力低的現(xiàn)象可能與低粘度的介質(zhì)有關。

genistein可作為抗氧化劑保護精子免受氧化應激[7，21-22]。在人類精子的研究中所使用的genistein的濃度一般為1 nM～100 μM，也有研究中genistein濃度高達500 μM[23]。盡管genistein對人或老鼠精子的生存能力幾乎沒有影響，但是它可以通過作為酪氨酸激酶的活性抑制劑來影響人類精子的運動能力[24]。總體而言，不同劑量的genistein對精子存在廣泛的作用。Martinez-Soto等[7]研究表明，在解凍液中添加10 μM genistein可以輕微增加精子的活力，減少解凍過程中ROS的產(chǎn)生和防止ROS誘導的DNA損傷，這提示genistein在10 μM濃度下主要以保護人類冷凍-解凍精子免受ROS損傷的方式來發(fā)揮作用。最近的研究證實盡管公牛冷凍精液解凍后在培養(yǎng)基中添加10 μM genistein，37 ℃孵育5 h后精子活率與對照組相比沒有顯著變化；但是genistein處理1 h后的精子與成熟卵母細胞的受精率高于沒有使用genistein處理的試驗組，而且其顯著性受精子濃度的影響[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，genistein雖然對Sp-TALP或 Fert-TALP中精子的活率沒有顯著的影響，但對于維持精子的生存能力是有益的。進一步說，在IVF受精液中添加genistein可以促進胚胎的發(fā)育(表4所示)?？赡苡捎隗w外受精之前使用genistein處理精子后，精漿中的ROS含量比較低，精漿中的抗氧化酶能及時清除多余的ROS，維持精卵融合以及胚胎發(fā)育過程中的氧化還原平衡，防止精子遭受氧化損傷和保持正常受精能力，進而保護精子的運動能力并促進胚胎的正常發(fā)育。另外，在獲能液中添加genistein精子的運動參數(shù)沒有顯著改變，只有少數(shù)的獲能的精子超活化(數(shù)據(jù)未顯示)?？紤]到人類精子獲能后發(fā)生超活化的比率偏低(4%～12%)[26]，與卵母細胞能夠成功受精的牛精子(獲能或超活化)比例也可能相對較低。而本試驗中精子參數(shù)均來自于CASA系統(tǒng)計算出的群體平均值，導致有限的超活化精子數(shù)量不能顯著影響兩種類型介質(zhì)中的精子參數(shù)。

近年來關于精子中第二信使系統(tǒng)的研究表明，caffeine作為一種磷酸二酯酶的非選擇性的抑制劑參與調(diào)控精子運動性、獲能、超活化和受精能力[27]。低劑量caffeine刺激精子可以改善和維持精子活力，而高濃度(>60 mM)則對精子參數(shù)有不良影響[8，28]。同時，低劑量caffeine對精子活力影響的研究也存在差異。Garbers等[8]報道指出，在精子稀釋液中添加6 mM caffeine，37 ℃孵育4 h后精子活力與對照組相比仍保持在較高的水平(55.2%/27.2%)。而Pereira等[29]在解凍后的牛精液中添加5 mM caffeine，在1～15 min的保存期間，未能提高牛活精子百分率和頂體反應精子的百分率。最后，盡管caffeine可以促進精子獲能、頂體反應和過度活化，但是其中任何一個變化都可能會縮短精子壽命，損害授精能力。Momozawa等[30]的研究表明當caffeine濃度為0.02～0.35 mM時并不影響受精率，然而在受精介質(zhì)中用5 mM caffeine處理精子會降低其活力和受精率。本試驗在Sp-TALP 或 Fert-TALP介質(zhì)中用5mM caffeine處理精子未能提高精子活力和促進體外胚胎發(fā)育，尤其是在Fert-TALP介質(zhì)中，精子經(jīng)caffeine和PHE混合物處理2 h后，VAP 和VCL低于對照組(P>0.05)和5 mM caffeine + 5 mM GSH處理組(P<0.05)，與Momozawa等報道一致。因此，試驗結果提示過量的caffeine刺激會使精子的活力下降，也可能如前所述由于粘性較低的介質(zhì)導致精子參數(shù)值較低。

程蕾等[31]將牛細管精液解凍后直接添加5 mM caffeine + 5 mM GSH，可提高精子的運動性和精清中谷胱甘肽過氧化物酶以及谷胱甘肽還原酶的活性。本試驗在聯(lián)合處理中也觀察到了精子參數(shù)的細微差別，處理組5 mM caffeine + 5 mM GSH 與對照組相比在Fert-TALP 介質(zhì)中能夠顯著增加游動優(yōu)勢(VCL)(P<0.05)和活力(BCF、MAD)(P<0.05)。結果提示caffeine和GSH之間對精子活力存在協(xié)同作用，正如前人的研究也指出caffeine和GSH通過共同作用于膜位點激活人類精子[32]，因此推測GSH可能會競爭性抑制caffeine與精子膜上的靶點結合，從而有效降低和緩沖caffeine濃度，維持和提高精子活力。這種處理方式在Fert-TALP介質(zhì)中也顯著增加了直線運動精子的比率，而卵裂率與桑椹胚發(fā)育率雖有較大幅度的提高，但與對照組相比差異不顯著，這與體外研究顯示直線運動精子與受精率呈正相關的報道[12，33]不一致。精卵細胞的結合受到多方面的影響，體外成熟的卵母細胞發(fā)生異常和透明帶硬化，均可能會阻礙獲能后精子的滲入[34]，因此需要更高的VCL、BCF和MAD來穿透卵母細胞并成功受精。事實上，一個高質(zhì)量精子的小亞群就足以獲得較高的受精率[35]，比如本試驗中5 mM GSH + 10 μM genistein以及10 μM genistein處理組，雖然在獲能前后精子的運動參數(shù)無顯著變化，但其體外受精卵裂率和囊胚率與對照組相近或有較大幅度的提高。

本試驗在Sp-TALP和Fert-TALP培養(yǎng)基中添加5 mM GSH + 5 mM caffeine或10 μM genistein，均能在一定程度上提高牛冷凍精液精子的運動性和生存能力；在受精滴中添加這兩種處理，卵裂率、桑葚胚發(fā)育率或囊胚發(fā)育率與對照組相比有較大幅度的提高，但差異不顯著。因此，如何利用不同的生物活性物質(zhì)處理冷凍精子并改進體外受精的關鍵技術，進而提高受精率和體外胚胎的生產(chǎn)效率，仍需要進一步的研究。

4 結 論

本研究結果表明，10 μM genistein或聯(lián)合應用5 mM caffeine與5 mM GSH處理凍精，可以改善牛冷凍精子運動性和生存能力，并對體外胚胎的發(fā)育有一定促進作用。