張少麗，王 珂，許 晗，彭 坤，閆海龍，曹馨元，藍賢勇，潘傳英*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 創(chuàng)新實驗學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

間性，即“雌雄同體”，是指在雌雄異體動物中偶爾出現(xiàn)的某些個體具有兩性性腺或生殖器官的現(xiàn)象。山羊角型性狀是山羊重要的經(jīng)濟性狀之一，與有角山羊相比，無角山羊更好管理，不會對管理人員和其他山羊個體造成傷害，還減少了對皮毛的損傷和懷孕母羊因打斗引發(fā)流產(chǎn)的幾率；此外，山羊角的生長會消耗一部分營養(yǎng)物質(zhì)，故培育無角山羊可減少這部分營養(yǎng)的浪費。早在19世紀(jì)，研究人員就發(fā)現(xiàn)了無角山羊具有諸多優(yōu)點，故采用在群體中選育無角個體來培育無角山羊品系。然而，隨著時間的推移，逐漸發(fā)現(xiàn)無角品系中雌雄比例失衡，出現(xiàn)了間性個體比例上升的現(xiàn)象，后來稱這種現(xiàn)象為山羊無角間性綜合征(Polled Intersex Syndrome, PIS)[1]。對于PIS山羊，個體生殖系統(tǒng)畸形，體內(nèi)激素分泌紊亂，不具有繁殖后代的能力且壽命較短，對于養(yǎng)羊業(yè)造成經(jīng)濟損失。為此，本文從無角間性山羊的形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)特征、核型分析、PIS區(qū)域結(jié)構(gòu)與功能，以及檢測等方面進行闡述，并綜述群體中篩選PIS山羊的方法，以期促進養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。

1 間性山羊的形態(tài)與解剖特征

根據(jù)性腺不同，間性山羊可分為真間性與假間性，其中，真間性是指一個個體同時具有兩種性腺(睪丸和卵巢，或包含睪丸和卵巢組織的兩性腺體)，而假間性則是指在同一個體內(nèi)只存在一種性腺(睪丸或卵巢)，但生殖器官的其他部分為兩性形式[2]?；诖?，無角間性山羊分為偏雄性無角間性山羊和偏雌性無角間性山羊。 偏雄性無角間性山羊具有雄性的生殖器官和性腺，但不一定發(fā)育完全；剖檢可見雌性的部分生殖器官或者性腺。 偏雌性無角間性山羊外觀可見雌性的生殖器官，但有不同程度的形態(tài)改變，它具有雌性的性腺；剖檢可見雄性的部分生殖器官或者性腺。

2 間性山羊的核型特征

研究表明，間性山羊的性染色體包括4種類型:(1)60，XX或60，XY間性；(2)60，XX/60，XY嵌合或鑲嵌間性；(3)60，XY/61，XXY嵌合間性；(4)59，XO/60，XX/61，XXX嵌合間性。根據(jù)間性的發(fā)生頻率，第(1)種類型的間性占絕大多數(shù)，最為常見；第(2)種類型為散發(fā)性的，具有一定的偶然性，頻率較低；第(3)、(4)種類型目前僅有1例報道[3]。1980年常洪通過對1660只初生羔羊性別進行統(tǒng)計提出，間性山羊遺傳基礎(chǔ)為雌性[4]。1982年Bongso認(rèn)為，大多數(shù)間性山羊染色體組成為60XX，但也有60XX/XY嵌合體[5]。Vallenzasca等[6]發(fā)現(xiàn)2例有雄性生殖器官且尿道下裂的無角間性山羊，指出它們分別為60XX和60XX/XY嵌合體。Bongso等[5]對有角間性山羊血液、骨髓以及皮膚進行染色體核型分析，揭示60XX/XY嵌合體在有角間性山羊中的頻率遠大于其在無角間性山羊中的頻率。Hamerton等[7]只在造血組織中發(fā)現(xiàn)染色體為60XX/XY嵌合體，且在不同組織之間XX細胞與XY細胞所含比例不同。Pailhoux等[8]對3只無角間性山羊的染色體組成及Y染色體篩選，排除了Y染色體易位和XX/XY嵌合現(xiàn)象。馮蜀舉等[9]發(fā)現(xiàn)一例60XX/XY嵌合體真兩性畸形間性山羊。陸建英等[10]在2例性畸形山羊中發(fā)現(xiàn)60XX/XY嵌合體。由此可見，大多數(shù)間性山羊性染色體都為60XX。

3 間性山羊的PIS區(qū)域結(jié)構(gòu)與功能

從20世紀(jì)20年代起，無角山羊在畜牧業(yè)中越來越受歡迎，同時山羊的無角間性現(xiàn)象也引起了產(chǎn)業(yè)廣泛關(guān)注。美國等飼養(yǎng)的薩能山羊、土根堡山羊、阿爾卑斯山羊、馬拉哥山羊及巴西土種山羊等品種均出現(xiàn)了間性山羊，其發(fā)生頻率在4%～15%之間[11]。在我國，亦發(fā)現(xiàn)國內(nèi)飼養(yǎng)的薩能山羊、承德無角山羊、馬頭山羊中出現(xiàn)間性個體，其發(fā)生頻率在3.82%～10.63%之間[9,12-15]。在20世紀(jì)前中期，美國和英國等學(xué)者發(fā)現(xiàn)間性山羊大多是無角的，有角間性山羊幾乎不存在，并且無角間性山羊的遺傳基礎(chǔ)大多數(shù)是雌性[1]。1980年，我國西北農(nóng)業(yè)大學(xué)常洪教授驗證了以上觀點[4]。利用系譜分析法探究間性性狀與無角性狀的關(guān)系，進而確定了間性是常染色體隱性遺傳與無角性狀緊密連鎖[16]，Vaimand等[17]將無角間性綜合征位點定位在1號染色體末端，隨后，Schibler等[18]應(yīng)用連鎖不平衡分析和染色體步移技術(shù)成功地將其定位在山羊染色體1q43的100 kb范圍內(nèi)(圖1a)。2001年，Pailhoux[19]克隆得到一段長約11.7 kb缺失片段(AF404302)，并發(fā)現(xiàn)該片段缺失導(dǎo)致了山羊PIS[16]。

圖1 山羊PIS結(jié)構(gòu)及檢測[16，29，31]a.PIS區(qū)域位于1號染色體1q43區(qū)；b.FOXL2、PFOXic、PISRT1和PIS區(qū)的位置關(guān)系及PIS區(qū)域的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；c.山羊基因型為PIS+/+、PIS-/+和PIS-/-時的電泳模式圖Fig.1 Structure and detection of goat PIS

最新研究表明，PIS區(qū)域突變會影響生殖細胞的支持細胞[20]，并且可以影響至少三個與性別相關(guān)主要基因-FOXL2 (ForkheadboxL2)、PISRT1 (PIS-regulatedtranscript1) 和PFOXic(promoterFOXL2inversecomplementery)的表達。FOXL2是一種卵巢分化相關(guān)基因，與人類眼瞼下垂疵皮綜合征相關(guān)，具有編碼蛋白質(zhì)的功能，是雌性山羊的性別決定基因[21]。該基因在卵泡細胞與初級卵泡顆粒細胞中高表達[22]，其突變不僅會導(dǎo)致動物出現(xiàn)卵巢早衰，還會導(dǎo)致人類心房間隔缺損(Atrial Septal Defect, ASD)[23]；該基因敲除的成年雌性小鼠會發(fā)生卵巢退化，而后又發(fā)育成了睪丸，表明FOXL2還具有阻止睪丸形成的功能[24]；當(dāng)FOXL2缺失時，可上調(diào)SOX9的表達[25]。PISRT1基因轉(zhuǎn)錄一段1.5 kb的mRNA，該mRNA不含開放閱讀框，是一種抗睪丸因子，可抑制SOX9基因的表達[26]。而SOX9是一種主要調(diào)節(jié)睪丸分化的因子[27]，是雄性生殖發(fā)育過程中不可缺少的，由此推測PISRT1基因與性別發(fā)育密切相關(guān)。PFOXic基因位于FOXL2基因啟動子區(qū)并與之反向互補，其中含有開放閱讀框[20]，它可表達由163個氨基酸組成的既定蛋白質(zhì)，有一個雙向啟動子驅(qū)動此蛋白的轉(zhuǎn)錄表達，并對FOXL2的轉(zhuǎn)錄具有增強作用。就三者關(guān)系而言，Boulanger等[28]發(fā)現(xiàn)PISRT1基因可能與山羊的間性無關(guān)，而FOXL2與山羊的間性有關(guān)，PFOXic與FOXL2共用一個雙向啟動子且它們的表達呈線性關(guān)系。

在PIS的物理圖譜研究中，發(fā)現(xiàn)PIS區(qū)距PISRT1大約30 kb，距FOXL2大約300 kb。據(jù)李東鋒等[29]報道：PIS區(qū)域的結(jié)構(gòu)中包含四個重復(fù)序列(LP、A2、RP和L1)，其中LP、A2和RP屬于反向轉(zhuǎn)座子(Retrotransposable Element, RTE)家族[30]。根據(jù)NCBI序列(AF404302)，以PIS區(qū)域的第一個堿基為起始點，第2-20 nt是CAGTT重復(fù)區(qū)，重復(fù)4次；21～548 nt為短散布元件(SINE)Art2；218～1 502 nt為逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)結(jié)構(gòu)域；2 770～2 856 nt為核酸內(nèi)切酶(EN)結(jié)構(gòu)域；3 041～3 140 nt為牛短散布元件tA2右單體的左半部分；RP中間完整的保留了RT結(jié)構(gòu)域(5 587～6 871 nt)；A2位于堿基3 988～4 565 nt之間，保留了部分RT結(jié)構(gòu)域(4 205～4 565 nt)[29](圖1b)?；贒NA序列分析，侯策等[31]成功克隆PIS區(qū)域全長，鑒定了30多個多態(tài)位點，并判斷可能與關(guān)中奶山羊的角型性狀有關(guān)，找到了1個tRNA轉(zhuǎn)錄位點、2個微衛(wèi)星、3個microRNA轉(zhuǎn)錄位點以及L1-EN、RT-nLTR-like樣保守結(jié)構(gòu)域，還發(fā)現(xiàn)1個CpG島、1對反向重復(fù)序列和2段串聯(lián)重復(fù)序列(圖1b)。

4 間性山羊的檢測方法

間性的出現(xiàn)受多種因素影響，目前其發(fā)生機理尚不清楚，但間性的出現(xiàn)會對山羊群體的飼養(yǎng)管理以及養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益等方面產(chǎn)生危害：(1)一般情況下，間性山羊尿生殖道呈畸形，會造成排泄障礙，后軀骯臟，嚴(yán)重影響發(fā)育，故死亡率極高；(2)間性山羊的性腺或生殖器官發(fā)育不正常，造成其激素分泌失調(diào)，代謝紊亂，從而影響情緒和行為，引起暴躁易怒，互相打斗、沖撞柵欄或飼養(yǎng)人員，甚至?xí)斐扇焉锬秆蛄鳟a(chǎn)等一系列問題，不利于飼養(yǎng)和管理；(3)間性羊生長速度較慢，飼料利用率低，肉質(zhì)差，造成經(jīng)濟效益低下；(4)間性羊不具有生殖能力，無法繁殖后代。已經(jīng)有研究報道間性是常染色體隱性遺傳，故間性基因攜帶者若不通過一些方法措施排除，會使群體內(nèi)間性基因的基因頻率越來越高，群體繁殖力越來越低，經(jīng)濟效益也會越來越低，為此，需要對間性山羊進行有效檢測，以便進行有效預(yù)防，提高養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟效益。

目前，間性山羊的檢測方法主要有3種：(1) 細胞生物學(xué)方法：利用染色體核型分析，觀察胚胎細胞的性染色體形態(tài)，判斷染色體是否發(fā)生嵌合或缺失，鑒定是XX染色體還是XY染色體，進而判斷其性別以及是否為間性。該方法的缺點是分析性染色體時需要獲得分裂中期的細胞，其操作難度較大，不方便，費時而且對于分子水平的突變、易位、缺失不能準(zhǔn)確鑒別[3]。(2) 免疫學(xué)方法：在早期胚泡期，雄性胚胎表達一種雌性胚胎所沒有的細胞表面因子H-Y抗原，Wachtel等[32]發(fā)現(xiàn)無角間性山羊為 H-Y+[32]，而已有研究表明無角間性山羊的遺傳基礎(chǔ)是雌性[4]，故可以將核型分析與抗原抗體免疫反應(yīng)相結(jié)合來排除無角間性山羊。Shalev等[33]利用A蛋白玫瑰花環(huán)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)相同基因型和性別的動物在它們細胞表面H-Y抗原的密度不同，據(jù)此，即可判斷間性山羊是偏雄性還是偏雌性。故利用H-Y抗原和抗體免疫反應(yīng)的原理可對胚胎進行間性鑒定。(3) 分子生物學(xué)方法：①Y特異性探針檢測法。即分離Y染色體上具雄性特異性DNA序列，TDF(TestisDeterminingFactor)基因與SRY(Sex-determiningRegionY)序列，用同位素標(biāo)記成探針，與目的DNA雜交，若結(jié)果為陽性，則該個體為雄性，否則為雌性。這種方法的準(zhǔn)確率超過95%。但這些特定序列通常具有種間特異性，故對每種動物都必須研制不同的探針[34]。②PCR法。即可根據(jù)間性個體與正常個體DNA水平上的差異，通過檢測不同的特征基因來確定家畜是否為間性。一種是通過合成SRY、ZFY或其他Y-染色體上特異性片段的部分序列作為引物，在一定條件下進行PCR擴增，能擴增出目標(biāo)片段的個體即為雄性，否則為雌性；另一種是在PIS區(qū)域的11.7kb片段內(nèi)外設(shè)計多對引物，根據(jù)擴增出的條帶的長度判斷的山羊基因型(圖1c)，進而通過選種選配等操作可在1～2代內(nèi)迅速降低PIS區(qū)缺失的基因頻率。例如：2012年楊波等設(shè)計了3對引物，141 bp的PIS-，449 bp的PIS+和300 bp的NEI，利用PCR的方法檢測了224個個體的奶山羊群體，發(fā)現(xiàn)該群體PIS-PIS+雜合個體的頻率高達66.9%，PIS+基因頻率為35.3%，子代出現(xiàn)間性山羊的可能性超過12%[35]。該法其特異性強、靈敏度高、快速、簡便且經(jīng)濟，有很大的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。③AFLP法。是一種選擇性擴增限制性片段的方法，具有RFLP技術(shù)的重復(fù)性好、可靠性高和PCR技術(shù)的高效性、方便性和安全性等優(yōu)點[36]，已廣泛應(yīng)用于動植物以及微生物遺傳多樣性的研究。

然而，在實際生產(chǎn)中，間性個體由于不具有繁殖能力等危害，必然被養(yǎng)殖戶淘汰。同時養(yǎng)殖戶更傾向于選育便于飼養(yǎng)管理且攻擊性小的無角羊，故為減少間性個體的產(chǎn)生，目前主要借助分子生物學(xué)方法。對山羊群體進行PIS缺失的雜合子和純合子鑒定，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定分類和遺傳學(xué)分析，調(diào)整山羊的選種和選配方式，從而降低PIS缺失的基因頻率，減少間性山羊出生的概率。目前分子生物學(xué)技術(shù)已非常成熟，通過與動物育種工作相互結(jié)合，這樣，不僅能突破傳統(tǒng)育種方式的禁錮，又能快速達到目的，減少間性山羊的出現(xiàn)，從而提高經(jīng)濟效益。

5 結(jié) 語

從意識到間性山羊?qū)π竽翗I(yè)的巨大危害開始，科研人員就從未停止過對山羊間性現(xiàn)象與機理的探索，目前已可以確定無角性狀與間性性狀是連鎖的，發(fā)現(xiàn)了PIS區(qū)域。但是，目前還不能確定PIS區(qū)域的完全缺失是否由無角間性性狀的突變所致，并且PIS區(qū)域的具體作用機制也不明確。此外，間性山羊的核型的變異與PIS區(qū)域的缺失與否有沒有直接聯(lián)系，PIS區(qū)域內(nèi)的各種元件究竟發(fā)揮著怎樣的作用，也還是未知。隨著分子遺傳學(xué)、生物信息學(xué)與實驗技術(shù)的發(fā)展，對山羊PIS的研究也將逐步深入，相信在不久的將來，山羊PIS的作用機制將被完全揭開，我們也會發(fā)現(xiàn)更高效、更精確的檢測方法，減少群體內(nèi)PIS個體的產(chǎn)生，促進我國畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展。