田曉琳，張賽航，孔德志，任雷鳴

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050017)

生物膜上所包含的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱膜蛋白，膜蛋白是細(xì)胞與周圍環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)交換和維系細(xì)胞生理功能的關(guān)鍵成分，執(zhí)行許多重要的生物功能，如信號的識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子交換、物質(zhì)運輸、細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的維護(hù)等。大多數(shù)膜蛋白不同程度地嵌入脂質(zhì)雙分子層中，其膜內(nèi)部分由一些非極性氨基酸組成，與膜緊密結(jié)合；膜外部分則由極性較高的親水性氨基酸組成。與基因組學(xué)不同，蛋白質(zhì)組學(xué)是以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式為研究對象，并對生命的復(fù)雜活動進(jìn)行全面和深入的研究[1]。鑒于膜蛋白的重要性，其組學(xué)的研究成為熱點。膜蛋白通過許多疏水氨基酸殘基錨定在膜結(jié)構(gòu)中，不易溶解于水性緩沖液系統(tǒng)中。因此，膜蛋白的制備和獲得是研究膜蛋白組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)難點，所提取蛋白純度的高低會直接影響最終的實驗結(jié)果。制備膜蛋白樣品時，傳統(tǒng)的方法是使用去污劑，根據(jù)其明顯的疏水性特點，常選用離子型SDS和非離子型Triton-X等。SDS會使多數(shù)蛋白完全變性[2]，限制了很多下游分析。非離子型去污劑較為溫和，但是對于膜蛋白，特別是具有多個跨膜區(qū)膜蛋白的抽提效果往往很差。本研究中選用的Novagen ProteoExtract 跨膜蛋白抽提試劑盒(簡稱TM-PEK)，是將離子型和非離子型去污劑按照一定比例配制而成[3]，提高了對膜蛋白的提取效果，并對下游分析的影響較小。

本研究建立了用 TM-PEK 對微量(約50 mg)大鼠腦皮質(zhì)組織進(jìn)行膜蛋白提取，經(jīng)FASP法酶解，再依據(jù)肽段的色譜保留行為進(jìn)行NanoLC分離，通過Orbitrap Fusion高分辨質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)，PD分析鑒定所提取到蛋白的方法；并用本法研究了出生2～3 d SD乳鼠與SD♂成年鼠腦皮質(zhì)膜蛋白的差異蛋白組學(xué)。

1 材料

1.1實驗動物健康♂1月齡SD大鼠(約100 g)、SD乳鼠(2～3 d)、3月齡健康♂成年SD鼠(約300 g)，由河北省實驗動物中心提供。實驗期間，飼以河北省實驗動物中心提供的固體飼料，自由飲食飲水。

1.2試劑Novagen膜蛋白試劑盒(提取溶液1、提取溶液2、TM-PEK試劑A、TM-PEK試劑B、蛋白酶抑制劑 Ⅲ)，德國Merck公司；碘代乙酰胺、脲素，美國Sigma-Aldrich公司；二硫蘇糖醇，生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF，索萊寶(北京)科技有限公司；BCA工作液(試劑A、試劑B、牛血清蛋白BSA)，天根生化科技(北京)有限公司；胰酶，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器納升型超高效液相色譜EASY-nLC1000、Orbitrap Fusion高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司)；Vivacon 500超濾濃縮管(德國Sartorius公司)；細(xì)胞超聲破碎儀(寧波新芝生物有限公司)。

2 方法

2.1納升液相色譜分離條件色譜柱：Acclaim PepMap RSLC 75 μm×15 cm，nanoViper C18；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度：0～3 min，2%～5%流動相B；3～58 min，5%～22%流動相B；58～68 min，22%～30%流動相B；68～73 min，30%～90%流動相B；73～78 min，90%流動相B。

2.2質(zhì)譜方法離子源：NSI電噴霧源[4]；噴霧電壓：2.1 kV；離子傳輸管溫度：300℃；射頻透鏡(RF-lens)：60%。掃描模式：速度模式(top-speed)；循環(huán)時間：3 s；動態(tài)排除：60 s。一級OT掃描：質(zhì)量分析器，靜電場軌道阱；掃描范圍，質(zhì)核比350～1 550；分辨率，120 000；最大注入時間，60 ms；自動增益控制(automatic gain control，AGC)：2e5。二級OT掃描：離子選擇，四級桿；選擇窗口，2 u；質(zhì)量分析器，靜電場軌道阱；分辨率，30 000；最大注入時間，70 ms；AGC：1e5；碎裂模式，高能碎裂(higher-energy collisional dissociation，HCD)；碎裂能量，37 %。質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Xcalibur軟件采集。

2.3膜蛋白的初提取將實驗鼠分為3組，包括健康♂1月齡SD大鼠、SD乳鼠(2～3 d)、健康♂3月齡成年SD大鼠，每組3只。取3只健康♂1月齡SD大鼠顳葉皮層，混合后勻漿(其他兩組同法提取膜蛋白，并進(jìn)行質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)分析)，分別取2份50 mg左右的勻漿組織，各加入2 mL冰提取溶液1和5 μL 蛋白酶抑制劑Ⅲ，在超聲細(xì)胞破碎儀中超聲5 s，共3個循環(huán)。冰上孵育10 min并溫和攪拌，4℃條件下，1 000×g離心5 min。將上清液(胞質(zhì)蛋白部分)移至新管中，冰上儲存。加入5 mL冰PBS溶解沉淀，4℃條件下，1 000×g離心5 min，棄上清。復(fù)溶沉淀，其中一份加入0.2 mL提取緩沖液2A(0.1 mL提取溶液2與0.1 mL TM-PEK試劑A混合)和5 μL蛋白酶抑制劑Ⅲ；另一份加入0.2 mL提取緩沖液2B(0.1 mL提取溶液2與0.1 mL TM-PEK試劑B混合)和5μL蛋白酶抑制劑Ⅲ，4℃孵育15 min并溫和攪拌。4℃條件下，16 000×g離心15 min，將富集膜蛋白的上清液移至新管中，用BCA法測定蛋白濃度。

2.4樣品蛋白濃度測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按BCA試劑A與試劑B為50 ∶1的比例配制適量BCA工作液，充分混勻。取2 g·L-1BSA(-20℃保存)，室溫融化后，按BCA法制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中分別加入BCA工作液200 μL，充分混勻后，于37℃孵育30 min，冷卻至室溫后，測定其在562 nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算蛋白的濃度。

2.5還原烷基化和FASP酶解[5]蛋白提取液中加入DTT，使終濃度為10 mmol·L-1，于37℃震蕩1 h。再加入碘乙酰胺，使終濃度為50 mmol·L-1，于室溫避光震蕩45 min。將上述蛋白樣品約100 μg加入到Vivacon 500濃縮超濾管中，離心15 min(14 000×g，20℃；下述未作說明時，同此條件)，棄濾液。繼續(xù)加入200 μL脲素至上述超濾管中，離心15 min棄濾液。再加入50 mmol·L-1NH4HCO3200 μL，再次離心15 min棄濾液；更換新的接收套管，在濃縮超濾管中加入50 mmol·L-1NH4HCO3100 μL，并在200 μg蛋白樣品中加入20 μL胰酶(濃度為0.1 g·L-1)，質(zhì)量比100 ∶1，37℃酶切2 h。繼續(xù)加入20 μL胰酶，37℃酶切12 h。離心15 min，收集肽段，再次加入50 mmol·L-1NH4HCO3200 μL，收集肽段，合并兩次的收集物。將上述合并后的肽段溶液低溫冷凍旋干后，用100 μL的0.1%甲酸水復(fù)溶，離心15 min，取上清20 μL放入進(jìn)樣小瓶中，操作流程見Fig 1。

Fig 1 The membrane protein extraction procedure

2.6數(shù)據(jù)分析方法

2.6.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.1軟件搜庫鑒定，搜索引擎：SEQUEST；數(shù)據(jù)庫：Uniprot大鼠全蛋白數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org)20170608；蛋白酶：胰蛋白酶(full)；最大漏切位點：2；母離子質(zhì)量精度：10 ppm；子離子質(zhì)量精度：0.02 u(OT)；固定修飾：脲甲基化(+57.021 u)；可變修飾：N端乙?；?+42.011 u)；N，Q脫氨基化(+0.984 u)，M氧化(+15.995 u)。

2.6.2物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)分析 計算所鑒定到蛋白的GRAVY(http://www.gravy-calculator.de)值，預(yù)測蛋白的疏水性；用TMHMM預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)域(http://phobius.binf.ku.dk/index.html)，計算其跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domains，TMDs)。利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[6]進(jìn)行細(xì)胞定位(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學(xué)過程(biological process)的基因本體(gene ontology，GO)分析。

3 結(jié)果

3.1肽段圖譜的采集膜蛋白樣品經(jīng)過胰蛋白酶酶解，經(jīng)納升液相分離、Orbitrap Fusion數(shù)據(jù)采集，得到肽段的一級質(zhì)譜譜圖和二級質(zhì)譜譜圖，典型的肽段譜圖見Fig 2。

3.2兩種膜蛋白提取液的NanoLC-MS/MS鑒定結(jié)果根據(jù)Proteome Discoverer 2.1軟件搜庫，提取緩沖液2A共鑒定出489個蛋白，1 108個肽匹配圖譜(peptide matched spectra，PMSs)。提取緩沖液2B共鑒定出2 590個蛋白，8 322個PMSs。如Fig 3所示，提取緩沖液2A與提取緩沖液2B共同鑒定的蛋白有387個，與提取緩沖液2A相比，提取緩沖液2B在蛋白數(shù)量上多鑒定出2 101個，PMSs多出7 214個。

3.3比較兩種提取液提取蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)首先，我們分析比較了被鑒定蛋白的分子量(MW)及等電點(pI)的分布情況[7]。如Fig 4A、4B所示，兩種提取液所提取蛋白的MW和pI的整體分布沒有明顯區(qū)別。大部分被鑒定蛋白的MW分布在20～40 ku，pI分布在5～7和8～9。與提取緩沖液2A相比，提取緩沖液2B鑒定的蛋白廣泛分布于各MW和pI組中；一些具有特殊性能的蛋白，如過酸蛋白或高分子量蛋白，僅由提取緩沖液2B中鑒定得到，如pI為12.15的40S核糖體蛋白S30(P62864)。

Fig 2 The representative MS2 spectrum for peptide

Fig 3 Difference in cytoplasmic membrane proteins betweenextraction buffer 2A and extraction buffer 2B

另外，我們依據(jù)計算出的GRAVY值[8]和預(yù)測出的TMDs，分析比較了兩種提取液對不同疏水性蛋白的抽提效率，如Fig 4C、4D所示。GRAVY值是測定蛋白或肽段親水性的常用參數(shù)，通常認(rèn)為GRAVY值為正值時，肽段和蛋白為疏水性，負(fù)值則為親水性。依據(jù)GRAVY值的大小，將所有鑒定的蛋白分為6組：<-1.5、-1.5～-1、-1～-0.5、-0.5～0、0～0.5、0.5～1組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取緩沖液2A和提取緩沖液2B所鑒定GRAVY值為正值的蛋白數(shù)量分別是30(6%)和272(11%)個。與提取緩沖液2A相比，提取緩沖液2B在各組中鑒定出更多的蛋白，兩種提取緩沖液所提取蛋白數(shù)均在-0.5～0組中最多，其次為-1～-0.5組，但為無顯著性差別增多，表明提取液2B對不同疏水性蛋白有更高的鑒定效率。

通過TMHMM對所抽提蛋白的TMDs進(jìn)行預(yù)測，提取緩沖液2A與提取緩沖液2B分別有48和618個蛋白具有跨膜區(qū)域，其中有21個(43.8%)和304個(49.2%)蛋白不止1個TMDs；大部分蛋白含有1～4個跨膜區(qū)域，其次為5～8個跨膜區(qū)域。兩種提取液所抽提蛋白的TMDs分布有明顯區(qū)別，提取緩沖液2B抽提出含有更多跨膜區(qū)域的蛋白，尤其是TMDs>14的蛋白只在提取緩沖液2B中存在。例如，提取緩沖液2B鑒定出煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(Q5BJ23)和NADH-泛醌氧化還原酶鏈5(P11661)都含有14個TMDs。這些數(shù)據(jù)更進(jìn)一步表明，與提取緩沖液2A相比，提取緩沖液2B更適用于酶解和鑒定含有高度疏水性多重跨膜區(qū)域的蛋白。

3.4兩種提取液提取蛋白的GeneOntology分析我們利用https://david.ncifcrf.gov/分析工具，根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的注釋[9]，對大鼠腦組織皮層蛋白質(zhì)表達(dá)譜中鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行了細(xì)胞定位、分子功能和生物學(xué)過程的分析。

提取緩沖液2A鑒定的489個蛋白中，331個(68%)蛋白可進(jìn)行GO分析。細(xì)胞定位分析結(jié)果表明：細(xì)胞器(organelle)蛋白303個(91%)，胞外區(qū)蛋白(extracellular region)202個(61%)，大分子復(fù)合物(macromolecular complex)蛋白181個(55%)，細(xì)胞內(nèi)的膜封閉腔(membrane-enclosed lumen)蛋白101個(31%)，突觸(synapse)蛋白73個(22%)，細(xì)胞連接(cell junction)蛋白66個(20%)(Fig 5A)。分子功能分析結(jié)果表明：涉及結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)和結(jié)合(binding)有關(guān)的蛋白分別是41個(12%)和301個(91%)，與抗氧化活性(antioxidant activity)和轉(zhuǎn)運活性(transporter activity)相關(guān)的蛋白分別是10個(3%)和36個(9%)(Fig 5B)。生物學(xué)過程分析結(jié)果表明：278個(84%)蛋白與單一生物過程(single-organism process)相關(guān)，223個(67%)蛋白參與生物過程調(diào)節(jié)(regulation of biological process)，194個(59%)蛋白與細(xì)胞成分的組織或生物合成(cellular component organization or biogenesis)有關(guān)，156個(50%)蛋白與定位(localization)有關(guān)，153個(46%)蛋白參與發(fā)育過程(developmental process)(Fig 5C)。

提取緩沖液2B鑒定出2 590個腦皮質(zhì)蛋白，其中1 720個(66%)蛋白可進(jìn)行GO分析。在細(xì)胞定位的分析結(jié)果中，膜蛋白1 164個(68%)，膜部分蛋白790個(46%)，細(xì)胞器蛋白1 473個(86%)，胞外區(qū)蛋白748個(43%)，細(xì)胞連接蛋白393個(23%)(Fig 5A)。在分子功能分析中，241個(14%)和1 326個(77%)蛋白分別與結(jié)構(gòu)分子活性和結(jié)合有關(guān)，195個(11%)和624個(36%)蛋白分別與轉(zhuǎn)運活性和催化活性相關(guān)，149個蛋白(8%)與分子功能調(diào)節(jié)(molecular function regulator)相關(guān)(Fig 5B)。在生物學(xué)過程分析中，840個(49%)蛋白與細(xì)胞成分的組織或生物合成相關(guān)，788個(46%)蛋白與定位有關(guān)，685個(40%)蛋白參與發(fā)育過程，1 359個(79%)蛋白參與單一生物過程，1 507個(88%)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)變化(cellular process)(Fig 5C)。

3.5應(yīng)用兩種膜蛋白提取液研究♂成年SD鼠和乳鼠的腦皮層膜蛋白如Fig 6所示，提取緩沖液2A對SD乳鼠共鑒定出461個蛋白，對♂成年SD鼠共鑒定出1 806個蛋白；提取緩沖液2B對SD乳鼠共鑒定出2 488個蛋白，對♂成年SD鼠共鑒定出2 383個蛋白。

2A提取溶液提取并鑒定到的♂成年SD鼠的膜蛋白數(shù)量(1 233個)明顯多于乳鼠的膜蛋白(277個)，♂成年SD鼠的胞外區(qū)蛋白(P=1.6E-72)、突觸蛋白(P=4.3E-70)明顯多于乳鼠，且得到明顯富集；化學(xué)性突觸中參與突觸前膜過程(presynaptic process involved in chemical synaptic transmission，P=2.2E-15)的蛋白也明顯多于乳鼠。KEGG通路分析顯示，♂成年SD鼠的蛋白富集到蛋白酶體(proteasome, P=1.2E-21)、突觸囊泡循環(huán)(synaptic vesicle cycle, P=4.0E-13)、碳代謝(carbon metabolism， P=1.6E-13)通路和丙酮酸代謝(pyruvate metabolism, P=7.0E-8)通路，而乳鼠的蛋白則富集到剪接體(spliceosome，P=3.4E-11)、核糖體(ribosome，P=1.7E-6)通路中。通過本實驗，證實大鼠皮層在發(fā)育過程中，以突觸為代表的細(xì)胞間的聯(lián)系發(fā)生了明顯變化，乳鼠蛋白的合成較成年鼠旺盛。如在成年鼠中提取到軸突蛋白-1(Q63372)可影響突觸和內(nèi)分泌細(xì)胞的功能，在體內(nèi)觸發(fā)突觸前結(jié)構(gòu)的新生；而富集到的神經(jīng)細(xì)胞囊泡循環(huán)蛋白-1 (Q62876) 和突觸小泡蛋白(P07825)則參與短期和長期突觸可塑性的調(diào)控。

Fig 4 Comparison of distribution of membrane proteins identified based on two different extraction buffers

Fig 5 The GO analysis of cortex membrane proteins in rat cerebral cortex compared between two different extractions

Fig 6 Difference in cytoplasmic membrane proteinsbetween suckling rats and adult male rats usingextraction buffer 2A(extraction buffer 2B)

2B提取溶液鑒定到的♂成年SD鼠的膜蛋白數(shù)量為1 679個，乳鼠的膜蛋白為1 708個，膜蛋白總數(shù)接近，但♂成年SD鼠的胞外區(qū)蛋白(P=1.5E-25)、突觸蛋白(P=8.7E-48)與乳鼠相比得到明顯富集。與催化活性相關(guān)(P=2.0E-14)的蛋白明顯多于乳鼠。KEGG通路分析顯示，♂成年SD鼠的蛋白富集到GABA氨基丁酸突觸(GABAergic synapse，P=2.6E-7)、谷氨酸能突觸(glutamatergic synapse，P=8.0E-7)、多巴胺能突觸(dopaminergic synapse，P=1.8E-5)、谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism，P=8.3E-6)及逆行神經(jīng)信號 (retrograde endocannabinoid signaling，P=6.6E-7)、催產(chǎn)素信號傳導(dǎo)通路 (oxytocin signaling path，P=3.1E-4)、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)(phosphatidylinositol signaling system，P=3.6E-4)。乳鼠蛋白則富集于剪接體(P=4.2E-56)、RNA轉(zhuǎn)運(RNA transport，P=4.4E-14)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum，P=7.0E-6)、真核細(xì)胞的核糖體生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes，P=6.0E-4)等與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的通路中。與提取液2A所得結(jié)論相同，成年大鼠皮層在發(fā)育過程中，以突觸為代表的細(xì)胞間的聯(lián)系發(fā)生了明顯變化，乳鼠蛋白的合成較成年鼠旺盛。

4 討論

根據(jù)膜蛋白在膜中的位置，可分為外在膜蛋白(extrinsic membrane proteins)和內(nèi)在膜蛋白(integral membrane proteins，IMPs)。外在膜蛋白約占膜蛋白的20%～30%，分布在膜的內(nèi)外表面，為水溶性蛋白，它通過離子鍵、氫鍵與膜脂分子的極性頭部相結(jié)合，或通過與內(nèi)在蛋白的相互作用，間接與膜結(jié)合；內(nèi)在蛋白約占膜蛋白的70%～80%，可不同程度地嵌入脂雙層分子中，具有較強(qiáng)的疏水性[10]?；谀さ鞍椎倪@種疏水性差異，可應(yīng)用不同的提取溶劑進(jìn)行抽提，不同抽提溶劑的組合可使疏水性不同的膜蛋白得到富集。Heo等[3]用6-氨基乙酸從小鼠腦組織海馬體中提取膜蛋白，利用Nano-LC-ESI-MS/MS 技術(shù)，鑒定出1 878個蛋白，其中28.39%為質(zhì)膜蛋白。Kang等[11]用1.5 mol·L-1羥基乙酸從C57BL/6J鼠腦組織海馬體中提取膜蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離、Nano-LC-MS/MS鑒定，大部分膜蛋白MW分布在450～1 236 ku。雖然傳統(tǒng)的非離子性表面活性劑SDS可以使多數(shù)膜蛋白變性溶解，但SDS在后續(xù)樣品處理過程中不容易除去[12]，抑制質(zhì)譜的離子響應(yīng)，反而不利于肽段的檢出；而非離子表面活性劑Triton-X的臨界膠束濃度(CMC)較低[13]，單獨使用對于膜蛋白的溶解并不理想。

本文建立了基于TM-PEK試劑盒提取、NanoLC-MS/MS分析鑒定大鼠皮層膜蛋白的方法。我們對比分析了TM-PEK試劑盒中的兩種提取緩沖液(提取緩沖液2A和提取緩沖液2B)對1月齡青年大鼠腦皮質(zhì)膜蛋白的抽提效果，經(jīng)質(zhì)譜分析提取緩沖液2A共鑒定出489個蛋白，提取緩沖液2B共鑒定出2 590個蛋白。與提取緩沖液2A相比，提取緩沖液2B多鑒定出2 101個蛋白，提取緩沖液2B對蛋白的抽提效率是提取緩沖液2A的5倍；用提取緩沖液2B能夠得到更多的MW>100 ku的蛋白，能鑒定出更多的GRAVY值為正值的蛋白。通過TMHMM對所抽提蛋白的TMDs進(jìn)行分析，兩種提取緩沖液對只含有1個TMDs的蛋白數(shù)量相對最多，而提取緩沖液2B在富集具有多個TMDs的蛋白時具有明顯優(yōu)勢。GO分析也提示，提取緩沖液2B所抽提的蛋白在膜、膜部分和擬核中得到明顯富集，而提取緩沖液2A無此類蛋白的富集。

用本法研究大鼠乳鼠及成年鼠的皮層膜蛋白，2A提取溶液鑒定到乳鼠、成年鼠的皮層膜蛋白數(shù)量分別為277個、1 233個；2B提取溶液鑒定到乳鼠、成年鼠的皮層膜蛋白數(shù)量分別為1 708個、1 679個。結(jié)果表明，2A提取溶液在提取膜蛋白時具有明顯的選擇性；對所鑒定到的蛋白進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析，提示成年鼠以突觸為代表的細(xì)胞間的聯(lián)系發(fā)生了明顯變化，而乳鼠蛋白的合成較成年鼠旺盛。