肖 敏，王根柱，戚 欣，李 靜

(中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理室，山東 青島 266000)

真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K)又稱鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅲ(CaM kinase Ⅲ)，是1985年由Nairn等[1]從哺乳動(dòng)物中首次發(fā)現(xiàn)的，屬于“α-激酶”家族。eEF2K共由724個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約81 499 u。已有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞面臨一定的應(yīng)激壓力時(shí)，eEF2K能夠磷酸化其細(xì)胞內(nèi)唯一底物蛋白eEF2，抑制蛋白質(zhì)合成過程中肽鏈延伸階段，降低細(xì)胞中氨基酸和能量的消耗，使細(xì)胞能夠在代謝壓力下得以存活[2-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，eEF2K在一些腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和活性會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生理進(jìn)程[3-6]，但在不同的腫瘤細(xì)胞中，eEF2K表現(xiàn)出不同作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道[3, 5-7]，在人成骨肉瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞中，抑制eEF2K能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)貧營養(yǎng)狀態(tài)的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；而在結(jié)腸癌、宮頸癌以及肝癌細(xì)胞中，貧營養(yǎng)狀態(tài)下抑制eEF2K則能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)貧營養(yǎng)條件的耐受，從而存活下來。

MDA-MB-231細(xì)胞為三陰性乳腺癌細(xì)胞，具有強(qiáng)侵襲性和高轉(zhuǎn)移性，臨床預(yù)后不良。由于缺乏治療靶點(diǎn)，臨床對(duì)于三陰性乳腺癌的治療仍是一大難題。為了進(jìn)一步揭示eEF2K在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的作用，本文觀察了eEF2K在不同培養(yǎng)條件下，對(duì)腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231生長的影響，并初步探討作用機(jī)制，為闡明eEF2K在三陰性乳腺癌中的作用以及開發(fā)新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器L-15培養(yǎng)基(杭州吉諾)；eEF2K shRNA(h) Lentiviral Particles和Control shRNA Lentiviral Particles (Santa Cruz)；eEF2、eEF2K、Akt、ERK、Src、mTOR、JAK、PI3K及其磷酸化抗體(Cell Signaling Technology)；β-actin 抗體、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗(杭州華安)；ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo Fisher)；吉姆薩染液(北京雷根生物)。Epoch2 酶標(biāo)儀、Protein Simple成像系統(tǒng)(Bio-tek公司)；Life拍照顯微鏡(Life Technology公司)。

1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建MDA-MB-231細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。MDA-MB-231細(xì)胞于L-15(含15%胎牛血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng)基中，置于37℃、無二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，胰酶消化并接種于24孔板中。 48 h后，各孔分別加入不同濃度的嘌呤霉素(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mg·L-1)，篩選出能夠殺死所有細(xì)胞的嘌呤霉素的最低濃度。同樣條件接種細(xì)胞于24孔板，分別加入eEF2K shRNA (h) Lentiviral Particles和Control shRNA Lentiviral Particles，感染細(xì)胞24 h，加入嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定抑制eEF2K表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株和空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)株，分別記作MDA-MB-231 sheEF2K和MDA-MB-231 shNC細(xì)胞。

1.3SRB法測(cè)定細(xì)胞增殖曲線MDA-MB-231、MDA-MB-231 shNC和MDA-MB-231 sheEF2K 3種細(xì)胞于L-15(含15%血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng)基中，置于37℃、無二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，胰酶消化，并以3 000個(gè)/孔接種于96孔板中。貼壁后，更換完全培養(yǎng)基。以MDA-MB-231細(xì)胞倍增時(shí)間大約為23 h為參考，設(shè)置時(shí)間梯度，分別培養(yǎng)0、12、24、48、72、96 h后，采用SRB法，于515 nm處測(cè)定各孔吸光度值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。同樣方法測(cè)定3種細(xì)胞在無糖和無血清培養(yǎng)條件下的增殖曲線。

1.4平板克隆檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力將MDA-MB-231、MDA-MB-231 shNC和 MDA-MB-231 sheEF2K 3種細(xì)胞于L-15 (含15%血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng)基中，置于 37℃、無二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，胰酶消化，并以500個(gè)/孔接種于6孔板中。37℃、無二氧化碳條件下培養(yǎng)15 d。棄去培養(yǎng)液，甲醇固定細(xì)胞3 min，晾干。吉姆薩染液染色15 min，流水洗去浮色，晾干，拍照。顯微鏡下計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)將MDA-MB-231、MDA-MB-231 shNC和 MDA-MB-231 sheEF2K 3種細(xì)胞于L-15(含15%血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng)基中，置于37℃、無二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，胰酶消化并以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞密度生長至80% 左右時(shí)，棄去培養(yǎng)基，RIPA裂解液裂解40 min后收樣，加上樣buffer煮沸15 min，保存于-20℃。配制8%的SDS-PAGE凝膠，上樣電泳分離后，轉(zhuǎn)印至NC膜上。5%的脫脂牛奶封閉2 h，4℃孵育一抗過夜。TBST洗4次，室溫孵育二抗1 h，ECL發(fā)光檢測(cè)3種細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)分子(Akt、ERK、Src、mTOR等)的表達(dá)和活化情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1eEF2K抑制的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建慢病毒顆粒感染細(xì)胞24 h后，加入嘌呤霉素篩選。取出部分細(xì)胞，Western blot檢測(cè)eEF2K的抑制效率。結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞MDA-MB-231 shNC相比，MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞中eEF2K的表達(dá)明顯下降，抑制效率可達(dá)71.76%(Fig 1A、1C)。并且eEF2K抑制后，細(xì)胞中eEF2K活性也降低，eEF2磷酸化明顯減少(Fig 1B、1D)。此外，與野生細(xì)胞MDA-MB-231相比，MDA-MB-231 shNC細(xì)胞中eEF2K的表達(dá)無明顯變化，表明空載體自身沒有影響eEF2K的表達(dá)。上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了eEF2K低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Different MDA-MB-231 cells constructed with

2.2抑制eEF2K后對(duì)不同培養(yǎng)條件下MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響將MDA-MB-231細(xì)胞及構(gòu)建的兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株接種于96孔板，SRB法分別測(cè)定3種細(xì)胞在完全、無糖和無血清培養(yǎng)條件下的增殖曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與完全培養(yǎng)條件下MDA-MB-231細(xì)胞相比，在無糖和無血清的培養(yǎng)條件下，MDA-MB-231細(xì)胞增殖速度明顯降低。但在無糖和無血清的培養(yǎng)條件下，相對(duì)于MDA-MB-231 shNC細(xì)胞，eEF2K明顯抑制的MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞仍表現(xiàn)出較快增殖，在72 h增殖率為分別31.08%和25.63%(Fig 2A、2B)。Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中 eEF2K的活性，發(fā)現(xiàn)在上述貧營養(yǎng)狀態(tài)下，MDA-MB-231細(xì)胞中eEF2磷酸化水平明顯升高，表明該條件下eEF2K被激活(Fig 2C、2D)。上述結(jié)果表明，貧營養(yǎng)條件下，eEF2K抑制能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長。

在完全培養(yǎng)條件下，與MDA-MB-231 shNC細(xì)胞相比，eEF2K明顯抑制的MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞增殖卻被抑制(Fig 3A)，并具有時(shí)間依賴性，96 h最高抑制率達(dá)33.02%。同樣，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制eEF2K表達(dá)的 MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞株形成的克隆數(shù)明顯少于其對(duì)照細(xì)胞，抑制率為22.48%(Fig 3B)。上述結(jié)果表明，在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，eEF2K抑制降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

2.3抑制eEF2K后對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)增殖信號(hào)通路活化的影響Western blot法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞及構(gòu)建的MDA-MB-231 shNC細(xì)胞、MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞在完全培養(yǎng)條件下，增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)與活化?；叶确治鼋Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞中Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平明顯降低，其上游分子PI3K活性幾乎不受影響(Fig 4A、4C)。而其他增殖相關(guān)蛋白如 Src、ERK、JAK磷酸化水平相比于自身蛋白表達(dá)均未見明顯減少(Fig 4B、4D)。表明在MDA-MB-231細(xì)胞中，完全培養(yǎng)條件下，eEF2K減少引起的細(xì)胞增殖抑制可能與 Akt-mTOR信號(hào)通路活化降低有關(guān)。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，貧營養(yǎng)狀態(tài)下，eEF2K激活，導(dǎo)致其下游底物eEF2磷酸化，降低eEF2與核糖體結(jié)合的能力，抑制翻譯延伸，減少氨基酸和能量的消耗，維持細(xì)胞生存[2-4, 8-9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與完全培養(yǎng)條件相比，貧營養(yǎng)狀態(tài)下的MDA-MB-231細(xì)胞增殖速度明顯降低。Western blot結(jié)果也表明，貧營養(yǎng)條件下，eEF2K被激活，表明蛋白合成被抑制，細(xì)胞增殖速度維持在較低水平。該現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道一致。相同的道理，在貧營養(yǎng)情況下，eEF2K抑制的MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞增殖速度明顯高于對(duì)照組細(xì)胞MDA-MB-231 shNC，且在72 h時(shí)最為明顯。表明eEF2K被抑制后，其蛋白合成抑制作用消失，細(xì)胞仍能繼續(xù)增殖，即抑制eEF2K能夠降低腫瘤細(xì)胞對(duì)貧營養(yǎng)狀態(tài)的敏感性，該現(xiàn)象也與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。而在完全培養(yǎng)條件下，利用SRB方法觀察細(xì)胞增殖情況時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組MDA-MB-231 shNC相比，MDA-MB-231 sheEF2K增殖速度明顯被抑制。進(jìn)一步應(yīng)用平板克隆實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，抑制eEF2K的表達(dá)也明顯抑制了MDA-MB-231 shNC細(xì)胞的克隆形成。上述實(shí)驗(yàn)均沒有觀察到野生的MDA-MB-231細(xì)胞與MDA-MB-231 shNC細(xì)胞具有明顯差別。這些研究表明，抑制eEF2K的表達(dá)，對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下細(xì)胞的生長具有不同的影響。

Fig 2 Effect of eEF2K inhibition on cell growth of different MDA-MB-231 cells in different media

Fig 3 Effect of eEF2K inhibition on cell growthof different MDA-MB-231 cells

為此，我們進(jìn)一步對(duì)完全培養(yǎng)條件下的3種細(xì)胞中增殖相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。細(xì)胞中增殖相關(guān)信號(hào)通路主要有3條：RPTK-Ras-MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路[10-13]。我們采用Western blot方法檢測(cè)了上述信號(hào)通路中的相關(guān)分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-231 shNC細(xì)胞相比，MDA-MB-231 sheEF2K細(xì)胞中Akt和mTOR的磷酸化水平明顯降低，而上游分子PI3K活化無明顯變化，其他分子如 Src、ERK、JAK磷酸化水平也均未明顯變化，提示eEF2K抑制后，對(duì)MDA-MB-231的增殖抑制作用可能與Akt-mTOR信號(hào)通路活性下降有關(guān)，且與上游分子PI3K無關(guān)。

Fig 4 Effect of eEF2K inhibition on protein expression andactivation of different MDA-MB-231

eEF2K作為翻譯延伸因子激酶可以磷酸化eEF2，抑制蛋白的翻譯延伸。本研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)條件下，eEF2K對(duì)細(xì)胞生長影響明顯不同。特別是發(fā)現(xiàn)完全培養(yǎng)條件下，eEF2K抑制后抑制了MDA-MB-231的增殖，并且與Akt-mTOR信號(hào)通路活化下降有關(guān)，提示eEF2K除了具有翻譯延伸因子激酶的作用以外，可能還存在著其它的功能，可能是三陰性乳腺癌細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)，值得今后進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理室完成的，感謝澳大利亞南澳洲健康醫(yī)療研究所Christopher G Proud 教授和王學(xué)敏老師提供的質(zhì)粒。)