王立竹，張明如，許 焱，伊力塔

（浙江農(nóng)林大學，浙江 臨安 311300）

酸雨（Acid rain）是目前人類面臨的嚴峻環(huán)境問題之一，酸雨在一定程度上會對植物產(chǎn)生傷害，如酸雨會導致葉片營養(yǎng)物質(zhì)流失，造成光合系統(tǒng)損傷，光合作用被抑制[1]；增加植物體內(nèi)的自由基，使抗氧化酶、保護酶活性下降[2]，導致植物對環(huán)境的適應性下降，影響植物正常的光合生理功能[3]；如pH為2.5的酸雨會顯著降低刨花楠的最大凈光合速率，提高植物的暗呼吸速率[3]，重度酸雨對杉木幼苗的光合能力和地徑生長有一定的抑制作用[4]等；但也有學者研究認為模擬酸雨可以提高樟樹的最大凈光合速率和表觀量子效率[5]，促進北美喬松幼苗的生長[6]。光是影響植物生長、存活、分布和更新的重要生態(tài)因子[7]，光照是植物生長的必要條件，但是沒有任何一種植物能夠完全吸收全光照下所有的光能[8]。前人研究表明適當?shù)恼谑a可以降低葉片的溫度、提高土壤水分含量及空氣濕度等[9]；即通過改變植物的生長環(huán)境，影響植物光合特性，進而影響植物生長。例如通過遮蔭來提高苦丁茶的產(chǎn)量和品質(zhì)以及茶樹的凈光合速率[10]，降低崖柏等植物的光補償點和飽和點等[11]；但也有研究表明過量的光強會引起光抑制，導致植物光合系統(tǒng)受損。例如栽植密度大而冠幅小，葉片處于強光照、高溫環(huán)境下，因此導致光抑制，進而影響庫爾勒香梨的產(chǎn)量和品質(zhì)[12]。

芒萁Dicranopteris dichotoma為里白科Gleicheniaceae芒萁屬Dicranopteris多年生常綠蕨類植物，耐旱、喜酸性土壤、耐瘠薄，多生長于亞熱帶低山丘陵森林植被的退化區(qū)，在馬尾松單優(yōu)群落、杉木以及楊梅園下層形成連續(xù)密布的單優(yōu)層片[13]，表明芒萁可在多種光環(huán)境下生長。George等通過控制性試驗[14-15]，認為蕨類植物構成的“生態(tài)篩”對森林更新過程具有選擇性作用。故當芒萁形成單優(yōu)層片后，會影響低山丘陵退化區(qū)植被的演替進程。據(jù)此，研究芒萁的生存適應條件可以探究芒萁對森林群落更新的影響。同時，芒萁被稱為酸性土壤指示性植物[16]，因此我們推測:芒萁更適應在遮蔭環(huán)境的酸性土壤中生長。因此擬采取模擬酸雨和光強雙因素控制試驗，探討模擬酸雨和光強對芒萁光合生理特征的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)內(nèi)，地處浙江省西北部（119°43′39″E；30°15′14″N），屬亞熱帶季風型氣候，溫暖濕潤，光照充足，雨量充沛，四季分明。年均降水量1 463.6 mm，主要集中于7月份。1月的平均氣溫為3.7 ℃，7月的平均氣溫為28.5 ℃，最高氣溫為40.5 ℃，最低氣溫為-9.3 ℃，年均降水天數(shù)160 d，無霜期約241 d[17]，土壤類型為酸性紅土壤。

1.2 試驗材料

在浙江省臨安市境內(nèi)玲瓏山森林公園內(nèi)選取長勢一致的1年生野生芒萁幼苗，于2016年5月栽于高15 cm、直徑35 cm的塑料花盆中，盆栽土壤為當?shù)丶t土壤，每盆一株，放置于實驗大棚內(nèi)，緩苗期保證自然光充足，用自來水澆灌，常規(guī)管理。緩苗期2個月后，選取長勢基本一致的芒萁幼苗隨機分成13組，每組15盆，共195盆（每個棚3個酸液處理組，1個無酸處理組，棚外1個全光對照組CK）。

1.3 試驗設計

實驗時間為2016年5—9月。參考前人的試驗方法[18]，設置4種不同酸雨濃度，即pH分別為3.0、4.0、5.6和7.0的蒸餾水；同時在每種酸雨濃度下設置4個光強梯度（采用遮蔭網(wǎng)方式），即21.6%、42.5%、69.8%和100%全光照，其中以pH 7.0的蒸餾水和100%全光照復合處理作為對照CK。

1.4 試驗方法

1.4.1 酸雨配制、噴淋方法及光強處理

根據(jù)浙江省酸性降水平均離子組成，將H2SO4、HNO3和CaCL2配置成SO42-和NO32-的摩爾比為5∶1的酸液母液，然后將母液用蒸餾水稀釋成pH分別為3.0、4.0、5.6的酸液[18]。用黑色尼龍網(wǎng)對大棚進行遮蔭處理，分別為一層遮蔭、兩層遮蔭和三層遮蔭，利用便攜式光照強度測定儀對大棚進行遮蔭強度測試，測出光照強度分別為69.8%、42.5%、21.6%。采用噴霧器人工模擬降雨向每盆芒萁幼苗噴淋酸液，噴施酸液的數(shù)量及頻率根據(jù)臨安市當月降水量而定（如圖1），并平均分配到每周，每周噴淋2～3次。

圖1 臨安近10年每月平均降水量Fig. 1 The statistical chart of average monthly rainfall in Lin’an for ten years

利用便攜式光合儀（Li-6400型，美國LI-COR公司）測定不同處理的盆栽芒萁光響應過程。測定時間為上午9:00—11:00，選擇成熟的功能葉片進行測定，每株測3片，共測3株。為保持其它環(huán)境因子的穩(wěn)定性，在測定過程中，選用開放氣路，氣體流速為0.5 L·min-1，將葉溫設置為25 ℃，相對濕度60%左右。將待測葉片在1 500 μmol·m-2s-1光強誘導下20 min以充分活化其光合系統(tǒng)，參考前人對蕨類植物光合曲線的測定[19]，設置12個光強梯度，即 0、10、30、50、100、300、500、800、1 000、1 200、1 500 和 2 000 μmol·m-2s-1，儀器自動記錄各光強下的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）等光合參數(shù)。

1.4.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定

采用非調(diào)制式葉綠素熒光儀（Yaxin-1161型，雅欣理儀科技有限公司）進行葉綠素熒光參數(shù)的測定，測定前暗適應20 min，選取一片葉片固定在感應區(qū)進行測定，每個處理重復測3次。計算每個處理的Fv/Fm，其中Fv為可變熒光，F(xiàn)m為最大熒光。

1.4.3 保護酶活性等參數(shù)的測定

本實驗采用硫代巴比妥酸法[20]測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA） 含 量；100T的 試 劑盒（南京建成）測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性；愈創(chuàng)木酚比色法[21]測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性；考馬斯亮藍染色法[22]測定可溶性蛋白質(zhì)（Soluble protein）含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對所有的數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和齊次性檢驗，然后進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和描述統(tǒng)計（Descriptive statistics）分析，并用Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 模擬酸雨與光強復合處理對芒萁光合作用的影響

2.1.1 模擬酸雨與光強對芒萁凈光合速率的影響

根據(jù)圖2可知，不同pH值酸雨和不同遮蔭強度處理下，芒萁凈光合速率隨光合有效輻射的增加而呈增大趨勢，進而趨于平緩；模擬酸雨同一pH值處理下，芒萁凈光合速率在69.8%下得到最大值，在21.6%下得到最小值，說明21.6%光強下會抑制芒萁的光合作用，pH 7.0時，全光對照大于21.6%光強處理小于42.5%和69.8%光強處理芒萁凈光合速率，說明適當遮蔭會增大芒萁的凈光合速率；同一遮蔭處理下，不同處理之間的凈光合速率存在顯著差異（P＜0.05），42.5%和69.8%光強時，芒萁在pH 7.0下凈光合速率最大，說明在此實驗條件下，此pH值更適合芒萁生長，其次為pH 4.0和pH 5.6，而在21.6%光強時，芒萁凈光合速率排序為pH 5.6＞pH 3.0＞pH 4.0＞pH 7.0，由此可見，21.6%光強對芒萁產(chǎn)生光脅迫。此外，從圖中可以看出，芒萁葉片凈光合速率均在800 μmol·m-2s-1光合有效輻射后趨于穩(wěn)定，說明此時達到芒萁的飽和光強。

圖2 不同模擬酸雨及光強對芒萁凈光合速率的影響Fig. 2 Net photosynthetic rate of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.1.2 模擬酸雨與光強對芒萁蒸騰速率的影響

從圖3可知，不同pH值酸雨和不同遮蔭強度處理下，芒萁蒸騰速率隨光合有效輻射的增加呈上升趨勢；同一pH值處理下，芒萁蒸騰速率表現(xiàn)為69.8%＞42.5%＞21.6%；均在69.8%光照時取得最大值，說明此時芒萁的光合系統(tǒng)能力較強；同一遮蔭處理下，芒萁的蒸騰速率均在pH 4.0酸雨濃度下得到最大值，總體上均高于全光對照處理的蒸騰速率，且在69.8%光照下，全光對照的蒸騰速率最小，說明全光照對芒萁造成了脅迫。

2.1.3 模擬酸雨與光強對芒萁氣孔導度的影響

圖3 不同模擬酸雨及光強對芒萁蒸騰速率的影響Fig. 3 Transpiration rate of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

根據(jù)圖4可知，不同pH值酸雨和不同遮蔭強度處理下，芒萁氣孔導度隨光強的增加而增加；同一pH值處理下，芒萁氣孔導度在69.8%光強下均大于CK，42.5%光強下與CK差異不大；同一遮蔭處理下，21.6%及42.5%光強下，氣孔導度變化趨勢一致，表現(xiàn)為pH 5.6＞pH 3.0＞pH 4.0，與全光對照相比，在pH 7.0蒸餾水處理下，氣孔導度大小為42.5%＞69.8%＞CK＞21.6%，表明光照會影響芒萁氣孔開放的大小。

2.1.4 模擬酸雨與光強對芒萁胞間CO2濃度的影響

根據(jù)圖5可知，不同pH值酸雨和不同遮蔭強度處理下，芒萁葉片的胞間CO2濃度隨光合有效輻射的增加而降低，均在21.6%光強下取得最大值；同一pH值處理下，芒萁葉片胞間CO2濃度均略低于CK；在pH 7.0蒸餾水處理下，不同光強下芒萁葉片氣孔導度大小排序為21.6%＞42.5%＞CK＞69.8%，表明光照對芒萁光合能力有一定的影響；同一遮蔭處理下，芒萁的胞間CO2濃度沒有明顯規(guī)律性趨勢。

2.1.5 模擬酸雨與光強對芒萁光合參數(shù)的影響

由表1中可以看出，最大凈光合速率Pmax在pH 7.0、69.8%光強處理時取得最小值，各處理之間差異不顯著；表觀量子效率AQY在pH 4.0、69.8%光強處理時得到最大值，說明在各處理中，此時的光合能力最強；各處理的光補償點LCP均顯著低于（P＜0.05）CK，說明處理的芒萁對弱光的適應性更強，同時，各處理下的LSP也均小于CK，表明芒萁在CK下耐蔭能力較差；暗呼吸速率Rd在CK時得到最大值，說明此時植物消耗的有機質(zhì)與其他處理較多，但各處理之間沒有顯著差異。

圖4 不同模擬酸雨及光強對芒萁氣孔導度的影響Fig. 4 Stomatal conductance of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

圖5 不同模擬酸雨及光強對芒萁胞間CO2濃度的影響Fig. 5 Intercellular CO2 concentration of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.1.6 模擬酸雨與光強對芒萁熒光參數(shù)的影響

如圖6所示，不同模擬酸雨及光強處理下，芒萁葉片F(xiàn)v/Fm值基本上均顯著大于（P＜0.05）CK。pH 5.6酸雨濃度下，F(xiàn)v/Fm隨光照強度的增加而降低，且在42.5%和69.8%光強處理下顯著低于（P＜0.05）21.6%光強處理；pH 4.0酸雨濃度下，3種處理的Fv/Fm均顯著高于（P＜0.05）對照，且在42.5%光強下取得最小值；pH 3.0酸雨濃度下，3種處理的Fv/Fm均顯著高于（P＜0.05）對照，不同處理之間沒有顯著差異，但均在42.5%光強下取得最小值；pH 7.0蒸餾水處理下，3種處理下的Fv/Fm顯著高于（P＜0.05）CK，且在69.8%時取得最大值。

表1 不同處理對芒萁光合參數(shù)的影響?Table 1 Photosynthetic parameters of D. dichotoma under different treatments

圖 6 模擬酸雨及光強不同處理對芒萁熒光參數(shù)的影響Fig. 6 Fluorescence parameters of D. dichotoma underdifferent acid rain and light treatments

2.2 模擬酸雨及光強復合處理對芒萁抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1 模擬酸雨與光強對芒萁丙二醛含量的影響

如圖7所示，pH 5.6濃度的酸雨下，69.8%光強的處理顯著增加（P＜0.05）了芒萁葉片的丙二醛含量，42.5%光強處理下芒萁葉片的丙二醛含量最低，表明在此酸雨濃度下69.8%光強會使芒萁葉片膜脂過氧化程度升高；pH 4.0濃度的酸雨下，芒萁葉片3種光強處理下丙二醛含量沒有顯著差異，隨光照強度的增加呈現(xiàn)先降后增的趨勢；pH 3.0濃度的酸雨下，3種光強處理之間丙二醛含量均有顯著差異（P＜0.05），其中，42.5%光強處理下芒萁葉片的丙二醛含量顯著低于（P＜0.05）21.6%和69.8%光強處理下丙二醛含量，21.6%光強處理下的丙二醛含量顯著高于（P＜0.05）69.8%光強處理下丙二醛含量，表明在42.5%光強下，模擬酸雨對芒萁幼苗細胞膜傷害程度最??；在pH 7.0蒸餾水處理下，3種不同的光強下芒萁葉片的丙二醛含量均顯著低于（P＜0.05）CK，CK的MDA含量分別是21.6%、42.5%和69.8%處理的1.4倍、1.6倍和1.8倍，表明CK下芒萁的膜脂結構和功能產(chǎn)生的傷害，相對比來說對芒萁葉片細胞膜的傷害最大。

圖7 不同模擬酸雨及光強對芒萁MDA含量的影響Fig. 7 Contents of MDA of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.2.2 模擬酸雨與光強對芒萁抗氧化酶活性的影響

根據(jù)圖8（a）可知，pH 5.6和pH 4.0濃度酸雨作用下，3種不同光強處理的芒萁葉片SOD活性組內(nèi)均沒有顯著差異，pH 3.0濃度酸雨作用下，69.8%光強下的SOD活性顯著高于（P＜0.05）21.6%和42.5%光強下SOD值；在pH 7.0蒸餾水處理下，芒萁葉片SOD活性在42.5%光強下顯著低于（P＜0.05）對照及21.6%和69.8%光強，且3種不同濃度酸雨及pH 7.0蒸餾水處理下芒萁葉片SOD活性均在42.5%光強下達到最小值，說明4種處理均對芒萁葉片產(chǎn)生了一定的生理傷害，而且除42.5%光強外，其他光照下產(chǎn)生的脅迫較大，但是脅迫沒有超過植物的自我保護范圍，植物可以通過提高抗氧化酶的活性從而來清除酸脅迫導致的活性氧。

根據(jù)圖8（b）可知，pH 5.6和pH 4.0濃度酸雨作用下，21.6%及42.5%光照下芒萁葉片POD活性顯著低于（P＜0.05）69.8%光照下POD活性，說明在此酸雨濃度下，69.8%光照處理對芒萁影響較大；而在pH 3.0濃度酸雨下，芒萁葉片POD活性隨光照強度的增加而降低，且21.6%光強下顯著高于（P＜0.05）42.5%及69.8%光強；在pH 7.0蒸餾水處理下，21.6%光照下的芒萁POD活性顯著高于（P＜0.05）CK及42.5%和69.8%光強處理的芒萁POD活性，說明此光強對芒萁產(chǎn)生了脅迫，因此POD活性加大。

圖8 不同模擬酸雨及光強對芒萁抗氧化酶活性的影響Fig. 8 Antioxidant enzyme activity of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.2.3 模擬酸雨與光強對芒萁蛋白質(zhì)含量的影響

根據(jù)圖9可知，3種濃度酸雨作用下，不同的光強處理的蛋白質(zhì)含量沒有顯著差異，但均在42.5%光強下取得最小值，表明42.5%光強處理下芒萁過氧化酶積累較小；在pH 7.0蒸餾水處理下，69.8%光強下芒萁葉片蛋白質(zhì)含量顯著高于（P＜0.05）其他光照下的蛋白質(zhì)含量，而21.6%光照下蛋白質(zhì)含量顯著低于（P＜0.05）其他處理下蛋白質(zhì)含量。

3 討 論

圖9 不同模擬酸雨及光強對芒萁可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig. 9 Soluble protein content of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

在相同的酸雨濃度處理下，芒萁在低光照下凈光合速率、蒸騰速率及氣孔導度均取得最小值，且低于CK，在42.5%和69.8%光強下取得最大值，說明在同一酸雨濃度下，光強會影響芒萁的光合作用，且隨著光強的降低光合作用受到抑制，這與其他學者的研究相一致。如張永霞[23]等通過對不同遮蔭條件下對羅布麻的光合特性進行研究，指出在50%光照條件下羅布麻葉片在光合速率、蒸騰速率等均高于30%光照處理下的對應值；呂晉慧[24]等人對金蓮花的光合特性進行分析得到42.5%的遮蔭處理顯著促進了金蓮花葉片的凈光合速率。相反，芒萁的胞間CO2濃度在21.6%光強下取得最大值，說明此時植物的光合能力較弱，此時的凈光合速率應降低，與上述討論相一致。此外，芒萁在pH 3.0酸雨濃度的處下，凈光合速率、蒸騰速率及氣孔導度依舊隨光合有效輻射的升高而增大，說明芒萁可以在酸性甚至強酸性土壤中生存，這與錢崇澎[25]等人的研究結果相吻合。從上面分析中可以看到，各處理下，芒萁基本上均在800 μmol·m-2s-1以上的光合有效輻射下達到飽和，且高于其他蕨類植物的光飽和點[26]。由于植物的光補償點和光飽和點是評價植物耐蔭性重要指標[27]，且根據(jù)朱巧玲[28]等人的研究，植物光補償點和光飽和點均表現(xiàn)為較高水平，那么說明該植物屬于陽生植物。由上述分析可知，芒萁在CK處理下的LCP均顯著高于其他處理，說明全光照下芒萁對弱光的適應能力較弱，因此可以得出芒萁為喜陽植物，這與陳波[29]等人的研究結果相一致；但在CK處理下的芒萁暗呼吸速率均顯著高于其他處理，說明此時由于光照的原因，芒萁自身消耗了過多的有機質(zhì)，反而不利于芒萁生長，因此可以推斷出，雖然芒萁為喜陽植物，但全光照卻不利于其生長。

Fv/Fm通?？梢詸z測植物光合機構對外界脅迫的響應[30]，本實驗中隨著酸雨濃度的增加Fv/Fm在不同的光強下呈上升趨勢，這與董蓮春[31]等人在不同酸雨梯度下對茶樹幼苗的研究結果一致，表明芒萁在適度的酸性條件下光合系統(tǒng)活性不會損傷，相反卻有一定的促進用，說明芒萁對酸雨有較強的適應能力；此外，由于在pH 7.0蒸餾水處理中，芒萁在3種不同光強下的Fv/Fm均顯著高于CK，說明適當?shù)恼谑a環(huán)境下更適應芒萁生長。

MDA作為膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量的高低能夠迅速反應出植物受到脅迫的傷害程度[32-33]。本實驗研究顯示芒萁葉片的MDA含量隨酸雨濃度的增加即pH值的降低而增大，說明一段時間的酸雨脅迫破壞了芒萁葉片的細胞膜結構，打破了超氧陰離子自由基代謝的平衡，這與郭慧媛[34]等人對毛竹葉片抗氧化酶活性中不同pH值酸雨對毛竹葉片MDA含量的影響結果相一致。酶活性的高低常用來作為植物抗逆性的指標[35]，本實驗研究結果顯示芒萁葉片SOD及POD活性隨酸雨濃度的增加而增大，說明芒萁葉片受到酸雨脅迫提高了植物體內(nèi)SOD活性，并迅速清除超氧陰離子自由基O2-同時生產(chǎn)大量的H2O2，POD活性隨之提高，這與趙棟[36]等人對茶梅在酸雨脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的變化相一致。隨著酸雨濃度的增加蛋白質(zhì)的積累可能是由于芒萁受到酸雨脅迫，而刺激植物體產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)來積累可溶性有機質(zhì)，提高細胞滲透，以保持細胞正常代謝[37]。此外，不同酸雨及光強下芒萁的MDA及蛋白質(zhì)含量，SOD和POD活性均在42.5%光強下取得最小值，同時pH 5.6酸雨濃度下的活性值整體最小，且MDA含量在3種光強下顯著低于CK，說明芒萁在42.5%光強和pH 5.6酸雨濃度下所受脅迫較小。

4 結 論

綜合以上結果可以得到以下結論:（1）在較強的酸性條件及中度光照下（42.5%、69.8%），盆栽芒萁的光合速率并未受到抑制，且在pH 7.0處理下，42.5%及69.8%光強下可以提高其凈光合速率等光合指標，具有較高的光飽和點；（2）酸性土壤及適當?shù)墓庹湛梢蕴嵘⑤降腇v/Fm，且高于全光照下的Fv/Fm；（3）強酸會提高芒萁MDA及蛋白質(zhì)含量以及抗氧化酶活性，在相同的酸雨濃度下，42.5%的光照下所帶來的脅迫較小。因此在一定酸度范圍內(nèi)，盆栽芒萁屬于喜酸性植物；盆栽芒萁具有較強的耐蔭性，同時又具有偏陽性的特點。我們的研究結果證實:盆栽芒萁的光強適應范圍變化于 -3.281 μmol·m-2s-1至910.667 μmol·m-2s-1范圍內(nèi)。